β葡萄糖苷酶的提取、純化及酶活測定方法

β-葡萄糖苷酶的提取方法
不同來源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。動植物體及大型真菌中的糖苷酶一般需要對酶源進行組織搗碎，然后用緩沖液浸提。常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等。pH值一般選用酶的穩定pH值；提取溫度適于低溫，一般為4 ℃。利用微生物發酵法生產β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一來源，一般微生物發酵都采用液態發酵。對于胞外酶來講，發酵液即為粗酶液；對于胞內酶，則需對微生物進行細胞破碎，使其釋放出β-葡萄糖苷酶。

2 β-葡萄糖苷酶的純化方法
粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸銨沉淀或用乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀等方法初步分離。β-葡萄糖苷酶的進一步純化，往往是根據具體情況，采用多種方法逐步分離。目前分離β-葡萄糖苷酶的方法較多，其中離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析兩種手段結合使用最為普遍，多數是先離子交換柱層析，后用凝膠過濾柱層析。離子交換柱層析方法中常用的是陰離子交換層析，如DEAE陰離子交換層析；同時，陽離子交換層析法也有一定的使用。除上述兩種分離方法外，也有其它層析方法用于分離β-葡萄糖苷酶，如使用疏水層析法和羥基磷灰石層析法等。此外，也有人采用雙水相萃取和親和層析的方法來分離β-葡萄糖苷酶，但關于這方面的研究報道較少。

3 β-葡萄糖苷酶活性測定方法
β-葡萄糖苷酶的活性測定方法很多，常見反應底物有對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纖維二糖、水楊苷等。由于酶與pNPG作用產生的對硝基苯可用分光光度法在400 nm處測定， 方法簡單、反應快速、反應活性大，所以大多數實驗采用pNPG作為底物的分光光度法測定酶活性。由于測定葡萄糖含量的方法很多，也有人通過測定葡萄糖含量來確定酶活力。孫迎慶等用多種方法測β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖為底物，用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶測定產生的葡萄糖量的方法來確定β-葡萄糖苷酶活性；用水楊苷為底物，將水楊苷裂解為水楊醇和葡萄糖，然后將酶解產物中的水楊醇用4-氨基安替吡啉作顯色劑顯色，用分光光度法在515 nm下比色測定β-葡萄糖苷酶活性。