上科大兩篇Cell聚焦抗結核病藥物靶點與人源大麻素受體

　　第一部分：

　　肺結核病目前仍然是全球人類健康的首要威脅之一。分枝桿菌是引起人類多種嚴重疾病的病原菌，包括結核病（TB）、麻風病、復合菌群布魯里潰瘍和肺非結核分枝桿菌病【1】。僅在2017年，估計就有1000萬新結核病例被診斷和130萬死亡病例出現。這使它成為導致人類死亡的主要傳染病之一。此外，多重耐藥和完全耐藥的結核分枝桿菌的出現，使它成為極其難以治愈的疾病【2, 3】。因此，發現新的TB藥物靶點是科學家們夢寐以求的事。

　　MmpL（Mycobacterial membrane protein Large）是分枝桿菌基因組編碼的一組膜蛋白，屬于抵抗、結瘤和分裂（RND）蛋白家族【4】。在革蘭氏陰性菌中，RND轉運蛋白（包括MmpL蛋白）分子能主動向胞外排出多種抗生素，因此在細菌耐藥中發揮重要作用【4, 5】。結核分枝桿菌（M. tuberculosis, Mtb）編碼13種MmpL蛋白，MmpL3、4、5、7、8、10和11已被報道參與分枝桿菌細胞膜的生物合成【6】。

　　MmpL3是其中唯一被認為是細菌（包括Mtb）細胞復制和存活必不可少的分子。實際上，下調MmpL3的表達，阻止細胞分裂并導致細胞迅速死亡【7】。MmpL3的序列在分歧桿菌和棒狀桿菌中是高度保守的，參與霉菌酸的運輸【8】。霉菌酸是分枝桿菌細胞外膜的關鍵成分，并對分枝桿菌的生長必不可少，導致脂質雙分子層的完全疏水和外源化合物的不可透過性，其中包括多種抗生素【9】。MmpL3的失活抑制了分枝桿菌中分枝酸合成的關鍵步驟。

　　目前已經開發的MmpL3抑制劑有二元胺、吲哚甲酰胺、二苯吡咯、金剛烷基脲類、和螺環。其中，二元胺中SQ109，作為抗結核藥目前處于臨床二期研究階段。它能很有效地抑制各種Mtb菌株，甚至包括臨床耐藥菌株。體外細菌對SQ109的變異率非常低，表明對這種化合物的抗性發展會非常慢【10】。此外，細胞水平的實驗表明，SQ109和其他藥物共同使用還具有協調效應。這也再次箏碼MmpL3作為藥物靶點的重要性。

　　但是，由于膜蛋白結構解析的難度比較大，目前關于MmpL家族蛋白的結構生物學信息非常有限。唯一被解析的結構是MmpL11的一個PC亞結構域（D2），只有88個氨基酸殘基的胞質部分片段【11】。

　　1月24日，上海科技大學iHuman研究所饒子和院士與楊海濤教授的合作團隊在Cell上發表了題為Crystal Structures of Membrane Transporter MmpL3, an Anti-TB Drug Target的研究論文，文中解析了結核分枝桿菌（M . smegmatis）MmpL3完整的晶體結構以及和四個潛在藥物形成的復合物的晶體結構。MmpL3結構的解析，對促進MmpL3的抑制劑的篩選以及抗結核病藥物的研究具有極其重要的意義。

　　提到恥垢分枝桿菌（Mycobacterium Smegmatis），此前BioArt也報道過饒子和院士團隊2018年10月份發表在Science上的題為An electron transfer path connects subunits of a mycobacterial respiratory supercomplex的文章【12】（Science丨立足抗結核病藥物靶點開發，饒子和院士團隊歷時多年解析分歧桿菌呼吸體超復合物III2IV2SOD2原子分辨率結構）。文中解析了恥垢分枝桿菌呼吸體超復合物III2IV2SOD2原子分辨率冷凍電鏡結構。

　　M . smegmatis是一種過氧化氫耐受株。與結核分枝桿菌（M.tuberculosi）比較接近，同屬分枝桿菌屬。恥垢分枝桿菌相對結核桿菌操作安全性要好的多，因此可作為研究結核桿菌的理想替代研究對象。饒子和院士團隊多年來專注于分枝桿菌編碼的關鍵蛋白分子的結構生物學研究，此次解析的重要膜蛋白分子MmpL3的晶體結構，也是多年來厚積薄發的結果。

圖1. Mycobacterium smegmatis編碼的MmpL3的整體結構

　　文中首先解析了單獨的MmpL3分子的晶體結構（圖1）。MmpL3的總體結構圖中，PN和PC結構域是它的胞外可溶區，這部分被稱為胞質孔狀結構域。TMN和TMC共包含12個跨膜螺旋，它們被稱為跨膜區結構域。

　　胞質孔狀結構域中，PN和PC都由β-α-β-α-β折疊組成，這一結構特點在MmpL 11的D2結構域（PC）【11】和AcrB的孔狀結構域（PN1，PN2，PC1和PC2）中也存在【13】。PN和PC交織在一起，中間形成一個空腔，右側圖更形象地將其顯示為灰色的表面電勢圖。這個空腔連接GT、GF和GB三個開口，這幾個開口處都有親水的氨基酸把守著，能夠允許特定的分子進出。

　　跨膜區結構域中，TMH IV和TMH X構成跨膜螺旋束的核心區域。在這兩個螺旋之間，有兩對親水殘基（Asp256-Tyr646和Asp645-Tyr257），它們之間能形成氫鍵來連接兩個螺旋。這兩對親水殘基在 MmpL家族中是保守的（MmpL7除外）【14】。已經有報道過的類似的三聯氨基酸Asp-Asp-Lys位于AcrB；三聯氨基酸Asp-Asp-Thr位于SecDF。這兩個三聯氨基酸都參與質子傳遞路徑【15-17】。值得注意的是，Asp-Tyr雙突變的MmpL3能夠使分枝桿菌在培養基中停止生長分裂【14】。這一結論和MmpL在質子傳遞中的重要作用具有一致性。

　　隨后，文章中通過MST（microscale thermophoresis，微量熱泳動）實驗驗證MmpL3及其突變體對抑制劑的結合強弱。結論是SQ109、AU1235、ICA38及 rimonabant與MmpL3的解離常數分別是是1.65 uM，0.003 uM，0.16 uM和29 uM。

圖2. MmpL3及其突變體對潛在藥物分子的抗性和藥物敏感性分析

　　確定了這些分子能和MmpL3的結合之后，進一步分別解析了MmpL3和四種抑制劑藥物的復合物的晶體結構。并對藥物結合口袋進行了分析（圖3）。圖中洋紅色（圖3B），綠色（圖3C），橘色（圖3D）和黃色（圖3E）的藥物分子分別對應SQ109、AU1235、ICA38和 rimonabant。它們都結合在質子傳送通道中，文中對這個結合口袋進行了精細分區，分為S1-S5五個亞區。其中，SQ109、AU1235和ICA38結合模式相似，占據了S3-S5三個亞區，而rimonabant跟其它上分子相比比較特殊，它的額外的兩個基團還占據了S1和S2亞區。這種藥物結合的結構特點，對于抑制MmpL3這一靶點蛋白的抗結核藥物設計具有非常重要的指導作用。

圖3. MmpL3的抑制劑結合口袋分析及其對藥物設計的指導作用

　　第二部分：

　　上海科技大學iHuman研究所劉志杰教授課題組長期聚焦大麻素受體的系統性研究，試圖理解其調控的重要生理功能和其結構基礎。目前他們已分別發表了CB1與拮抗劑AM6538復合物的晶體結構（Cell, 2016）、CB1分別與激動劑AM841及AM11542復合物的晶體結構（Nature, 2017）。在前期工作的基礎上，為攻克CB2受體結構及調控機制，劉志杰團隊與美國東北大學的Alexandros Makriyannis教授團隊合作并設計了CB2的新型拮抗劑AM10257。研究團隊通過理性突變位點預測和大量實驗篩選，最終獲得了高質量的CB2蛋白樣品并成功解析了CB2與AM10257復合物2.8埃分辨率的晶體結構。相關工作以Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB2為題于2019年1月11日在線發表于Cell雜志上，該論文1月24與饒子和院士團隊的Cell論文同時正式出版。

　　附近三年上海科技大學iHuman研究所發表的部分代表性論文：

　　1、Li, X., Hua, T., Vemuri, K., Ho, J. H., Wu, Y., Wu, L., ... & Liu, Z. (2019). Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB2. Cell.

　　2、Zhang, B.,........ & Rao, Z. (2019). Crystal Structures of Membrane Transporter MmpL3, an Anti-TB Drug Target. Cell

　　3、Peng, Y., McCorvy, J. D., Harps?e, K., Lansu, K., Yuan, S., Popov, P., ... & Liu, Z. (2018). 5-HT2C receptor structures reveal the structural basis of GPCR polypharmacology. Cell, 172(4), 719-730.

　　4、Yang, S., Wu, Y., Xu, T. H., de Waal, P. W., He, Y., Pu, M., ... & Zhao, S. (2018). Crystal structure of the Frizzled 4 receptor in a ligand-free state. Nature, 560(7720), 666.

　　5、Song, G., Yang, D., Wang, Y., de Graaf, C., Zhou, Q., Jiang, S., ... & Liu, Z. (2017). Human GLP-1 receptor transmembrane domain structure in complex with allosteric modulators. Nature, 546(7657), 312.

　　6、Hua, T., Vemuri, K., Nikas, S. P., Laprairie, R. B., Wu, Y., Qu, L., ... & Liu, Z. (2017). Crystal structures of agonist-bound human cannabinoid receptor CB 1. Nature, 547(7664), 468.

　　7、Hua, T., Vemuri, K., Pu, M., Qu, L., Han, G. W., Wu, Y., ... & Liu Z. (2016). Crystal structure of the human cannabinoid receptor CB 1. Cell, 167(3), 750-762.

　　注：部分內容引自上海科技大學iHuman研究所官方微信號。

　　參考文獻

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　　16. Murakami, S., Nakashima, R., Yamashita, E., Matsumoto, T., and Yamaguchi, A. (2006). Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism. Nature 443, 173–179.

　　17. Tsukazaki, T., Mori, H., Echizen, Y., Ishitani, R., Fukai, S., Tanaka, T., Perederina, A., Vassylyev, D.G., Kohno, T., Maturana, A.D., et al. (2011). Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export. Nature 474, 235–238.