中大長江學者發表CRISPR成果

　　在細胞中，對于不穩定的蛋白質來說，穩定性調控是特別重要的。然而，目前還沒有開發出一種方便而無偏差的方法，能夠確定蛋白質穩定性的調節因子。近期，來自中山大學腫瘤防治中心的研究人員，在《Cell Discovery》雜志發表的一項研究中，通過將全基因組CRISPR-Cas9文庫與雙熒光蛋白穩定性報告基因以及高通量測序相結合，開發出了一種蛋白質穩定性調節因子篩選試驗（Pro-SRSA）。

　　本文通訊作者康鐵邦博士，是中山大學腫瘤防治中心/華南腫瘤學國家重點實驗室PI、國家杰出青年基金獲得者。康博士于2003年獲德國Bielefeld大學生物化學博士學位，1998年至2008年一直在美國、德國從事細胞生物學研究工作。2008年5月，全職回國（中山大學“百人計劃”引進人才）；2009年，獲得國家自然科學基金重點項目、“973”計劃項目（課題組組長）；2011年，獲得國家杰出青年基金、“973”計劃項目（學術骨干）；2012年，獲得國家肝癌重大專項基金（子課題）。長期從事細胞生物學的研究工作，主要研究方向：細胞周期調控、腫瘤靶向治療和個體化治療的基礎研究、腫瘤的轉移調控等。在SCI雜志發表論著48篇，通訊或第一作者在Cancer Cell, J. Clin. Invest., J. Natl. Cancer Inst., Cancer Res., J. Biol. Chem., Cell Res., Oncogene, FASEB J. 等國際主流雜志上發表論著17篇。

　　在多種生理條件下，可調節的蛋白質降解在細胞周期進程、細胞的生長、分化和信號轉導中起著至關重要的作用。一些與癌癥相關的蛋白質的降解異常，可能導致細胞的轉化，而許多其他蛋白的失調與其他疾病相關。因此，了解蛋白質降解的精確調控，對于了解生物機制，以及為疾病開發治療性干預措施，都是一個重要的問題。然而，因為缺乏一種有效的方法，公正和全面地描述一個蛋白質內穩態的調節因子，仍然具有挑戰性。

　　到目前為止，有多種方法可以用于確定哺乳動物細胞中蛋白質穩定性的關鍵調節因子，然而每種方法都有明顯的缺點。最近出現了一種基于熒光的系統，可在單細胞水平上監測蛋白質動態。在不同的技術當中，總體蛋白質穩定性（GPS）分析和蛋白質周轉試驗（ProTA）已被證明發揮很好的作用。在這兩種方法都是基于雙熒光，一個與感興趣的蛋白質融合，另一個作為參考。

　　最近，有幾個研究小組表明，CRISPR-Cas9文庫是開展全基因組功能缺失篩選的一種簡單有效的系統。與mRNA的短發夾RNA相比，CRISPR-Cas9將插入缺失突變引入基因組DNA中，以介導基因敲除。因此，純合基因敲除賦予了篩選很高的靈敏度，而不完整的敲除則保留基因功能。

　　在這項研究中，研究人員開發了一種蛋白質穩定性調節因子篩選試驗（Pro-SRSA），將全基因組CRISPR-Cas9文庫與雙熒光為基礎的蛋白質穩定性報告基因以及高通量測序結合起來，篩選蛋白質穩定性的調節因子。使用Cdc25A作為例子，Cul4B-DDB1DCAF8被確定為Cdc25A的一個新E3連接酶。此外，Cdc25A在賴氨酸150上的乙酰化作用——是由p300/CBP乙酰化和由HDAC3去乙酰化，可阻止泛素蛋白介導的Cdc25A降解。

　　這項研究首次報道，乙酰化——作為一種新的翻譯后修飾，可調節Cdc25A穩定性，研究人員認為這種無偏差的全基因組CRISPR-Cas9篩選方法，可能廣泛用來全面確定蛋白質穩定性的調節因子。