爭鳴｜成人大腦中有沒有神經干細胞？

　　○成年人的大腦里面還有沒有神經干細胞存在，這些神經干細胞是否還能繼續生成新的神經元?過去10多年，業內人普遍認為，存在;然而，近幾年的一些研究卻認為，不存在。

　　一般來說，證明存在，比較簡單;證明不存在，可能工作量就比較大，需要更嚴格的鑒定標準，經得起統計學方面的考驗。

　　無論如何，當神經發育結束后，成熟的人類大腦一共有大約800億神經元和800億神經膠質細胞，要在所有這些細胞中尋找神經干細胞，是很有挑戰的。

　　為了治病和變聰明

　　成年人大腦中是否有神經干細胞，科學家關注這個問題，有兩個簡單的理由。

　　首先，如果成年人的大腦中還存在著神經干細胞，并且能夠通過某種方法刺激這些神經干細胞分裂增殖，并重新分化為神經元，可能是一種非常有效的治療神經損傷和神經退行性疾病的新療法。

　　神經元受到損傷或疾病侵擾后會死亡。許多神經退行性疾病，如阿爾茨海默癥，帕金森綜合癥等疾病，主要病理后果是神經元的死亡。神經元的死亡是導致認知功能下降的主要原因。

　　因為神經元無法重新分裂產生新的神經元，目前針對人類大腦損傷或者神經退行性疾病，基本缺少有效的治療方法。

　　另外，過去大概20年，許多實驗室研究了成年小鼠大腦中神經干細胞的功能。

　　他們發現，在成年小鼠大腦中的海馬區部位有不少的神經干細胞。這些成年神經干細胞與神經發育期間的神經干細胞相似，可以繼續分裂，產生更多的神經干細胞，同時也可以分化成神經元和神經膠質細胞，且分化后的神經元可以整合到已經形成的神經環路中發揮功能。

　　另外，其他一系列研究表明，如果對小鼠進行運動或智力訓練，小鼠的許多高級認知功能，如學習和記憶能力，就會有明顯增加。

　　大家一致認為，小鼠大腦中的海馬區域是負責學習和記憶的關鍵腦區，進一步的研究表明，在海馬區域的神經干細胞對小鼠認知功能的提高起著非常重要的作用。

　　基于這些研究結果，大家認為，成年動物大腦中存在的神經干細胞及其產生新生神經元的能力，也是大腦神經可塑性的一個重要組成部分。

　　由此推斷，如果成年人的大腦中也存在類似的神經干細胞，也可以通過運動或者智力訓練來增加自己的認知能力，或者說變得更加聰明。

如何鑒定人類大腦神經干細胞?

　　人類大腦的樣品主要有兩個來源, 最常見的是由死者家屬捐獻的大腦組織。另外，部分患有腦部疾病的病人在治療過程中需要做部分腦組織切除手術，切除出來的大腦組織，經病人及其家屬同意，也是樣品的另一個主要來源。

　　由于樣品來源的特殊性，對樣品進行任何預處理的可能性雖然有，但是很低。總結下來，目前大概有以下幾種方法尋找并鑒定人類大腦神經干細胞。

　　一是，直接尋找神經干細胞。

　　成年的神經干細胞與胚胎發育期間的神經干細胞基本類似(包括特異性蛋白，所處腦區，和轉錄組特征等)。神經干細胞可以分裂，且含有一些在神經干細胞中相對特異表達的蛋白質(標志蛋白)。

　　其次，可以尋找由神經干細胞分化而產生的新神經元。與原有的老的神經元相比，這些新生成的神經元也表達一些相對特異的標志蛋白。

　　第三種是首先通過標記物來標記所有正在分裂的細胞(如Brdu, Bromodeoxyuridine, 中文名是溴脫氧腺苷。它是DNA中脫氧胸苷的類似物，可以在細胞分裂時參入新和成的DNA中，常用于檢測分裂的活細胞)，然后過一段時間再尋找含有這些標記物、同時也表達神經元特異性蛋白的細胞。這類細胞就是由神經干細胞分化而產生的神經元。

　　以上三種方法主要是通過抗體染色實驗完成的。

　　最后，通過對大腦特定區域的細胞進行單細胞測序，可以得到每個細胞樣品的轉錄組數據庫。通過對該數據庫進行生物信息分析，可以幫助我們鑒定具有神經干細胞轉錄組的細胞。

　　雖然實驗手段經歷了幾個技術世代—— 從組織切片原位免疫染色為主、分散細胞染色后通過流式儀計數，到整批細胞混在一起核酸測序(bulk tissue RNA-seq)，再到單細胞(核)RNA測序(見下表)—— 關于成年人大腦海馬區神經干細胞究竟存在與否，以及有無內源成年神經生發，至今尚沒有共識見解。

　　此處我們將所羅列文章的結論籠統地寫作“有”還是“沒有”發現成年新生神經元。至于結論是“有”的文章中，關于存在數量是多還是少的信息，以及成年人類樣品的疾病等背景，大家可以去原文找尋。由于時間有限，我們沒有逐個比較這些染色實驗中樣品準備的技術細節，以及抗體選擇、優化是否合理。例如，我們這里不詳細討論樣品中神經干細胞或新生神經元特異性抗原暴露充分與否，或者抗體是否非特異性的結合了其它蛋白。同樣，BrdU是否可以少量摻入非分裂細胞DNA，或者生物樣品準備的技術細節對于14碳同位素分析的影響，我們也不在這里討論。

　　科學技術總有瑕疵，但伴隨更多數據不斷產生，以及多種不同技術的相互輔證(比如FISH RNAscope(RNA原位雜交技術)和multiplex免疫染色(多試幾種抗體)聯合)，技術層面的障礙會越來越小。

　　如果采用染色的策略，那每一個細胞染出來了就捕獲了那個細胞，剩下的就是通過什么標準去給每個細胞身份賦值定性為神經干細胞。

　　定錯了，無非制造兩個結果，不是假陽性，就是假陰性。如果不考慮抗體質量糟糕結合了靶目標之外的其它蛋白這種技術障礙，剩下的問題就是——

　　◢ 需要多少個神經干細胞/新生神經元特異性身份標志物?

　　◢ 兩三個夠不夠用?

　　◢ 選定的標志物特異性是否足夠強?

　　◢ 神經干細胞/新生神經元標志蛋白是否也會在某些神經膠質細胞中表達?

　　◢ 如果表達，通過查看膠質細胞標志物是否可以排除?

　　◢ 來自小鼠，猴子，幼年人類檢測中獲得的先驗知識，能不能完全照搬的用在成年人腦神經干細胞的探尋?

　　更好的方法

　　除了經典的細胞標志蛋白染色技術，我們認為通過新技術單細胞測序研究細胞身份應該是一個更準確的方法。

　　那么，單細胞(核)測序能不能捕獲上面通過染色實驗(見上表)發現的那些成年人腦神經干細胞(若有)?

　　理論上應該沒問題。

　　染色實驗是通過抗體直接檢測蛋白質，而核酸測序是檢測編碼蛋白的信使RNA。目前默認設置的常規測序深度通常能在每個細胞(核)平均測到3、4千個表達基因，當然增加開銷可以測得更深。染色實驗一般最多染3、4個蛋白，而且通常這些蛋白標志物表達量不會太低，所以編碼它們的RNA應該能被單細胞(核)測序抓到。

　　如果只關心3、4個基因表達，那么細胞(核)的測序，從某種角度上看就相當于針對20萬細胞樣品通過檢測3、4個細胞標志物來鑒定神經干細胞(此外，除了鑒定細胞類型，單細胞測序結果通過大數據分析也可以推斷細胞分裂的情況，能分裂也是干細胞的特點之一)。

　　那么具體如何通過單細胞(核)mRNA測序鑒定細胞類型?

　　首先，利用每個細胞平均測到的3、4千個表達基因的轉錄組為依據，我們可以在相對高數量的維度上通過大數據分析將彼此相似的細胞歸并為一類，就是聚類分析。

　　在捕獲細胞(核)數量足夠，測序深度良好的情況下，每類細胞還可以再細分成一些亞型。雖然所用軟件或計算方法可能不同，聚類分析本身是一個基于關聯性的無偏過程。

　　但對于分出來的每個類別(cluster)的細胞身份認定最終還是人定的，并且這是個極度依賴先驗知識的步驟。

　　具體來說，通過數據分析可以算出每個cluster表達明顯高的50到100個基因，再根據這些基因里有什么已知細胞類型的幾個標志物來決定這個cluster的身份，最后可以再結合FISH或者抗體染色去復證。

　　當然這50到100個基因中還有希望發現新穎的，更純的細胞身份標志物。同理，單細胞測序后的聚類分析也可以重新驗證某些傳統的細胞身份標志物是否確實不在其它細胞類型中表達(細胞特異性)。比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發現在成年人腦海馬區中，常用的新生神經元標志蛋白Dcx不僅僅是未成熟新生神經元的標志。

　　由于人類大腦樣品來源不易，大多數情況下只能在單一時間點取樣，而不像動物模型那樣可以獲得幾個時間點real-time的樣品。但是即使在單一時間點，同一組織內每個細胞的狀態也略有差別。換一句說，在一群細胞中會存在處于某個生物過程中不同階段的細胞亞群。

　　現有的大數據分析技術可以通過一個稱為Pseudo-time trajectory的分析方法從單一時間點取樣的單細胞(核)測序數據中，找到這些細胞亞群，從而模擬整個生物過程。

　　比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發現通過分析成年小鼠，豬，恒河猴的單細胞測序結果，可以描繪一條從Neural intermediate progenitor cells(神經干細胞)，到新生神經元，再到成熟神經元 (granule cell)的一個神經細胞分化成長的過程。然而在同樣條件下，研究者們在成年人類大腦海馬區就測不到這個細胞過程。基于此結果，該研究認為在這些人類大腦樣品中不存在神經干細胞。

　　2021年發表在Neuron 雜志這兩篇單細胞核測序文章 [1,2] 均聚焦探尋成年人腦海馬區的神經干細胞和新生神經元。結果簡言之，都沒找到。

　　在成年人海馬腦區齒狀回區域探尋神經干細胞和神經生發過程，是因為早先實驗在成年哺乳動物，比如嚙齒目中的小鼠，非人靈長類，以及幼年人類海馬區齒狀回發現了顯著的新生神經元蹤跡，或者至少存在神經元生發過程。

　　至于成年人大腦中神經 “干細胞”，如果存在，目前大家普遍認為它們存在的區域和其它特性與其它動物模型中和幼年人類腦中發現的干細胞類似。這一先入為主的觀點是否正確或限制了我們的視野，因為沒有先驗依據，暫時無法回答，但值得關注。

　單細胞測序的挑戰

　　單細胞(核)mRNA測序也不是完美無瑕的，通常缺點恰恰出自優點。

　　單細胞測序同樣依賴先驗知識來給細胞身份賦值定性。分析的時候選定幾個參數之后，聚類是可以由計算機自動計算完成的。但是把每個cluster認定成什么細胞類型、亞型、狀態，仍然是需要人為依照先驗標志去賦值。

　　打個比方，如果蒙上眼睛去摸比如20萬只動物，每個有3、4千特征值(甚至多些達到上萬個特征)，就可以把比如大象分成一堆，長頸鹿，綿羊，貓狗，禽類，魚類各自成堆，分析的細一些還可以把貓和狗，雞鴨鵝繼續分開。

　　我們之所以能夠身份賦值成功，是因為先驗知識，我們本來就認識這些動物。試想如果我們原先不認識羊駝這種動物，數量又不大，那就很有可能把比如7、8只羊駝分到綿羊一堆里，也就是假陰性：沒有羊駝。

　　同理，如果成年人腦神經干細胞與小鼠、豬、猴子、人類幼年的這些先驗知識都不相似呢?

　　比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 這20萬細胞核已經成功捕獲了神經干細胞，但是沒有認出來(假陰性)，卻隱匿在了星形膠質細胞，小膠質細胞，少突細胞，interneuron群里。

　　好在成年人腦神經干細胞一旦被單細胞測序成功捕獲了，隨著技術進步可以測更高通量的細胞和測序深度增加(各個平臺都有這樣新的解決方案推出)，這個干細胞cluster理論上應該冒出來。雖然也許這個cluster會與，比如，膠質細胞或者內皮細胞共用很多個標志基因，但測序分辨率夠了應該能找到區別。

　　更為重要的，成年神經元生發作為一個過程，軌跡(trajectory)應該是存在、可測且清晰。

　　因為如果最終發現某些astrocytes或者microglia類細胞有神經干細胞功能，它們不可能瞬間身份轉換成與某種原有成年腦細胞一模一樣，所以通過轉錄組分析應該可以鑒定出來。

　　就算轉錄組和蛋白組的聚類和軌跡分析都不能賦值鑒定成年神經干細胞(若存在，且捕獲)，那還可以嘗試基于染色質結構的聚類和軌跡分析，包括增強子enhancer特征，等等。在多組學這個趨勢下，單細胞(核)DNA甲基化特征，lncRNA特征，單細胞ChIP-seq也早晚都會進入市場成為有用的工具。

　　如果以上方法還是無法找到成年神經干細胞，說明什么?

　　一個可能性是成年人腦中的類干細胞和類神經元生發過程在正常生理狀態下處于靜息或受抑制狀態。

　　例如，最新的一項研究發現，在成年小鼠大腦的海馬區衰老的神經干細胞抑制了其附近正常干細胞的分裂和分化功能。通過化學手段去除老化的干細胞可以大大促進正常神經干細胞的分裂與分化。

　　同理，成年人類大腦中的神經干細胞可能也是需要某些條件激活的，比如損傷，某種疾病，特定遺傳，或者環境背景。這類的調節未必是線性的也許是個動力系統，所以前途仍然是光明的。

　　隨著更多數據的產生，特別是那些染色找到成年人腦神經干細胞的課題組，可應用多組學單細胞(核)測序來確證自己的發現。

　　舊的bulk tissue mRNA-seq也是個寶庫(通常都存在GEO數據庫)，因為很多是某種背景或者損傷的樣品，未必能找到同等的再去做單細胞測序。結合單細胞測序標志庫，現在有很多建立的數據分析流程 [3] 可以把bulk-seq做反卷積(deconvolution)看其中各個細胞成分的差異基因。

　　另外，經常聽到的單細胞測序的其它缺陷，比如組織酶解消化過程會改變細胞狀態和轉錄組，或者造成transcripts丟失。我們自己的經驗也發現成年動物腦組織酶解消化過程，如果條件沒有最佳化，會造成大量細胞丟失。

　　新推出的一些測序方案也許可以克服這些缺陷，使得測量結果更加原汁原味。

　　比如，spatial sequencing可以將組織切片的 “像素點” 不經酶消化直接原位轉化成 “單細胞” 再測序。又如單細胞測序后通過組織切片FISH RNAscope驗證可以找到不受樣品消化影響的轉錄產物。

　　還沒有定論

　　成年人大腦中約有800億個神經元，以及大約等同或稍多數量的膠質細胞和其它細胞。

　　嚴格來講，要知道這每人1600億個細胞群體中 “有” 還是 “沒有” 神經干細胞和成年新生神經元，如果找到了要下結論 “有”，那么一個關鍵問題是如何確定找到的細胞是神經干細胞?這1600億細胞群體中，神經干細胞大概占多少?

　　如果沒找到，下結論 “沒有”，那么一個重要的問題是樣品的覆蓋率和數量是否足夠?比如用單細胞測序，每次抽樣20萬個細胞，要測多少次才能下結論?要考慮是否經得起統計學方面的檢驗。

　　在多組學大數據的時代，讓成年人腦神經干細胞探尋的子彈再飛一會兒。

背景小知識

　　所有動物大腦組織的形成都必須要經過一個神經發育(neurodevelopment)的過程。神經發育早期的神經組織，包括大腦，的主要細胞類型就是神經干細胞(neural stem cells)。

　　這些神經干細胞可以分裂增殖(divide and proliferate)，同時它們中的一部分也可以停止分裂而分化(differentiate)成神經系統中的主要兩類細胞：神經元(neuron)和神經膠質細胞(glia)。分化后的神經元會生長出神經纖維(axons and dendrites)，然后彼此連接形成復雜的神經環路(neural circuits)。由神經元形成的神經環路，通過與各種類型的神經膠質細胞相互作用，就形成了完整的大腦神經網絡系統，從而控制各種類型的神經功能。這些神經功能包括感覺功能，如冷熱痛癢，嗅覺，味覺，聽覺，視覺功能，運動功能，和各類高級的認知功能。當神經發育結束后，成熟的人類大腦一共有大約800億神經元和800億神經膠質細胞，意味著要在所有這些細胞中尋找神經干細胞，是很有挑戰的。神經干細胞分化成為神經元是一個不可逆的過程，神經元沒有能力重新分裂而產生新的神經元，因此死亡以后也就得不到補充。在人的一生中，神經元數量隨著年齡增長而逐漸減少。與神經元不同，神經膠質細胞在某些特定條件下，如受到損傷以后，可以重新回到能分裂的狀態，并產生新的神經膠質細胞。在低等脊椎動物中，如斑馬魚，某種神經膠質細胞，如視網膜中的穆勒細胞，在損傷后會回到神經干細胞狀態，從而產生新的神經元和神經膠質細胞。神經膠質細胞的這種功能在哺乳動物中大家普遍認為完全喪失。 在大腦組織發育結束后，為了保證其內部的神經網絡系統處于一個相對穩定的狀態，從而能夠正常行使其功能，成熟后的神經元一般喪失了生長神經纖維的內在能力，同時神經元所處的外部環境也是一個相對抑制的狀態。內外因素協同作用來維護神經網絡的穩定運行，這也是哺乳動物大腦損傷或受疾病侵擾后無法再生并修復被破壞的神經環路的主要原因。成熟的神經網絡并不是完全固定不變的，所有神經元都具有一定的可塑性(neural plasticity)，即神經元之間的連接可以有一定程度的調整(如連接密度和強度等)。已有研究表明神經可塑性對調節各類神經功能或修復神經損傷有很大的作用。

　　一般情況下，神經可塑性是隨著年齡的增長而不斷下降, 所以人類在兒童時期可以有更好的能力學習和掌握新的東西，如學習多種語言。另一方面，大腦組織在受到損傷或疾病侵擾后，在兒童時期大腦得到修復的機率也會更大。

參考文獻：

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