實驗材料 BALB C nu nu裸鼠人胃癌細胞株SGC-7901
試劑、試劑盒 人纖維蛋白原凍干粉人凝血酶凍干粉凝血酶
儀器、耗材 針頭手術剪超凈臺縫合線
實驗步驟
一、實驗材料準備
BALB /C nu /nu裸鼠12只，雌雄兼用， 4～6周齡，體質量18～20 g，SPF級條件下飼養。傳代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌細胞株。
二、裸鼠皮下移植瘤的建立和傳代
1. 收集體外培養的SGC-7901細胞，使細胞含量為5 ×107 /ml，制成細胞懸液然后取0. 2 ml注入裸鼠頸背部皮下。
2. 當皮下移植瘤長至直徑為1 cm左右時無菌操作取出移植瘤，去除壞死組織，漂洗后，將瘤組織切成約1～2 mm的小塊，研磨過濾制備成單細胞懸液局部注入另一只裸鼠頸背部皮下，如此成瘤后鼠間反復傳5代。
三、原位移植模型的建立
1. 將第5代致瘤的裸鼠脫頸處死后無菌操作取出第5代皮下移植瘤，剔除纖維包膜和壞死組織，選取生長良好呈淡紅色魚肉狀的瘤組織用眼科剪切成1 mm ×1 mm ×2 mm的小塊，浸泡于已配好的纖維蛋白原溶液中置于冰袋上備用。
2. 實驗裸鼠術前禁食，以1 ml氯胺酮( 5 g/ml)腹腔注射麻醉后，固定四肢并進行常規皮膚消毒，選腹左側正中切開皮膚1. 5 cm，逐步進腹，顯露胃壁后將胃拉出，在胃大彎處近胃竇旁用1 ml無菌空針頭劃破胃壁漿肌層，植入3～4塊瘤組織塊，并在瘤表面滴上約10 μl凝血酶，使其覆蓋瘤組織表面，約10 s左右待凝血酶與纖維蛋白原發生反應形成膠狀物后，瘤組織塊黏合在胃壁破損處，然后將胃壁口納入腹腔。
3. 分別采用6-0縫合線縫合腹膜(含肌層) ，3-0縫合線縫合腹壁，關腹結束手術，以上操作均在超凈臺內進行，共建6例模型。
四、原位移植致瘤率及移植瘤侵襲和轉移情況觀察
1. 移植術后精心飼養， 定時觀察所有裸鼠全身狀況、進食情況、運動情況和腹部體征。
2. 當荷瘤鼠出現消瘦、精神萎靡及弓背等全身衰竭體征時，脫頸處死，探查腹腔中瘤體生長狀況、有無腹腔積液形成及周圍臟器受累情況。
3. 然后留取原位瘤組織，胸腹腔重要臟器胃、肺、肝、腹膜等組織，用10%甲醛固定后，石蠟包埋、切片、HE染色，進行組織病理學檢查。
4. 原位瘤組織中增殖細胞核抗原( PCNA)的檢測采用免疫組化染色( SP法) ，細胞核染成棕黃色為陽性細胞，陽性結果判斷標準：隨機取5個高倍視野，以其陽性細胞百分比來判定， ≤5% ( - ) ，6% ～25% ( + )，26%～50% ( + + ) ，≥51% ( + + + ) 。
其他
一、實驗討論
建立一種符合人體胃癌組織自然生長狀態的侵襲和轉移的理想模型是研究胃癌發病機制及防治措施的關鍵所在。最初的人胃癌裸鼠皮下移植瘤盡管在形態、生化特征及功能方面與人胃癌十分相似，但是由于腫瘤組織周圍結締組織的包裹等因素限制了腫瘤的轉移，從而不能較真實地模擬人體內胃癌的發生與發展。隨著實驗方法的不斷改進，原位移植模型能夠克服皮下移植模型的不足，它在腫瘤的浸潤及轉移上更接近臨床人胃癌發展的基本規律，與皮下移植模型相比具有顯著的優越性。此后，人們又發現胃癌組織塊原位移植模型與癌細胞懸液原位移植模型相比，具有更高的移植成功率及轉移率，尤其是OB膠用于胃癌組織原位移植造模方法，使實驗操作更為簡便， 建模成功率更高。目前，“OB膠粘貼法”已廣泛運用于模擬人胃癌臨床轉移的原位移植模型的構建，它具有原位移植的優點，不僅保持了癌組織結構的完整性，并且使建模操作相對簡便，術中出血少，術后恢復快，明顯提高了動物存活率，為人類胃癌的生長、轉移機制及治療方面的研究提供了一種較理想的模型。
然而，OB膠是一種化學膠,在臨床上主要應用于外科手術中創面及吻合口的封閉，它在人體內并不能完全被吸收，因此在腫瘤模型中可能影響腫瘤組織的外生性生長，易使模型中腫瘤組織中心形成大片壞死。在人體凝血過程中，纖維蛋白原與凝血酶反應能夠形成纖維蛋白固化物，發揮有效的止血作用。利用這一原理，作為多功能生物高分子的纖維蛋白已在生物工程中的組織再生及傷口愈合中被廣泛地應用，它不僅能夠止血和使局部傷口組織粘連，還能被機體吸收從而不會影響腫瘤細胞的生長。此外，凝血酶能促進腫瘤血管的形成和腫瘤微環境的組織重建，為腫瘤的轉移提供一個相容的環境。因此，我們利用纖維蛋白原和凝血酶的反應物纖維蛋白作為OB膠的替代物來粘貼移植手術中的組織塊從而進行模型的建立。我們的研究結果表明，“纖維蛋白原- 凝血酶”粘貼法建立的裸鼠胃癌原位移植模型具有較高的原位移植成功率，腫瘤生長迅速且較少出現壞死， 6例模型中有5例出現重要臟器的轉移、3例動物模型出現腹腔積液，因此我們認為此法能夠成功再現人體胃癌的臨床轉移過程，為人類胃癌的生長及轉移機制的研究提供一種理想的動物模型。