傳代細胞培養實驗

實驗方法原理 當初代培養成功，細胞生長增殖形成單層細胞后，進而擴展匯合，占滿一切空間，此時需要進行分離培養。這一操作稱傳代或再培養。如拖延傳代，細胞會因增殖過度，培養基營養枯竭和代謝產物積累而發生中毒。80%匯合或剛匯合細胞是理想傳代階段。

實驗材料 細胞

試劑、試劑盒 Hanks胰蛋白酶EDTA培養液

儀器、耗材 吸管培養瓶

實驗步驟

1.  吸除培養瓶內舊培養液；

2.  向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限；

3.  置溫箱中2~5 分鐘（或在室溫中，把培養瓶放在倒立顯微鏡臺上鏡下觀察），當發現細胞胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化；

4.  吸除消化液，向瓶內注入Hanks液數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉；注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失；如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液；

5.  用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液；吹打勿用力過猛，以免傷害細胞；

6.  計數板計數后（如非實驗用，不計數亦可），把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養。

注意事項

1.  把握發了傳代時機，已如前述，在80%~90%匯合階段最好，過早傳代細胞產量少，過晚細胞健康狀態不佳。

2.  消化時間要適度，過短細胞不易從瓶壁脫落，過長細胞可脫落流失。

3.  消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。

4.  各種細胞對消化反應不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應根據所用細胞特點制定適宜消化措施。有的細胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來，但這樣容易傷害細胞，細胞大片脫落掉，不易計數，應盡可能采用消化法分散細胞為妥。

5.  消化傳代良好時，細胞受損害少，細胞懸液均勻，各分裝樣品中數量誤差小，細胞生長增殖速度一致，實驗結果可靠性大。