使用顯微鏡通過形態學檢測細胞凋亡

使用顯微鏡通過形態學檢測細胞凋亡

    細胞凋亡的檢測有定性或定量兩類方法。定性可以通過形態學觀察，包括光鏡、電鏡和熒光顯微鏡等，也可以通過瓊脂糖電泳來檢測特征性DNA梯形條帶。定量研究的首選方法為流式細胞儀。原位末端標記法則既可用于定性，又可用于半定量。此外，相比熒光顯微鏡，激光共聚焦技術提供了更高的分辨率，并可以作一定程度的斷層掃描，利用相應的軟件可以把圖像壓縮成三維立體圖形。熒光顯微鏡和(或)激光共聚焦與定時攝影技術相配合，可以記錄凋亡過程的動態變化。

    如前所述，早期的凋亡主要依賴光鏡和電鏡進行形態學研究。光鏡主要是對HE染色的切片進行觀察，在鏡下可見染色體核濃縮等。但因其提供的信息有限，現已不常用。利用相差顯微鏡，在高倍下觀察可見凋亡細胞 膜的泡化(bledding)及細胞膜和核膜的折光性改變，但這些改變不是普遍現象。相對而言，電鏡的分辨率高，可以顯示細胞各個亞器官的變化。熒光顯微鏡既可定位，又可做定量分析，因而更常用。

    (一)透射電子顯微鏡

    電鏡分為透射電鏡和掃描電鏡，觀察細胞一般使用透射電鏡。透射電鏡的優勢是分辨率高(o．2nm)，放大倍數為幾萬至幾十萬倍。在電鏡下，細胞內器官諸如線粒體、溶酶體、核糖體和內質網等的結構都一清二楚。觀察細胞凋亡時不僅可以檢測凋亡小體，同時也能觀察超微結構的變化。電鏡一般都由專人操作，在此僅介紹樣品的制備方法。

    用于電鏡的樣品既可以是組織也可以是細胞，取材的要點是快速和新鮮。固定液一般用2％的鋨酸溶液，用時在冰浴中預冷。切取的組織塊應0．5-1cm3，切下后迅速置于固定液中。對懸浮細胞可以離心收集(1 000-1 500r／min，5min)，棄培養液后迅速加入鋨酸固定液，于冰浴中固定。對貼壁細胞的處理則有兩種：既可以用常規消化離心方法收集細胞，然后固定；也可以在棄去培養液后直接在培養皿中加入固定液，至少固定30min，然后刮取細胞，離心收集。這樣做的好處是能保留細胞最原始的狀態，排除了胰酶消化和離心對細胞的影響。然而鋨酸的固定會使細胞脫水，無法用常規的離心法收集細胞(細胞會保持懸浮)，但可以用過濾離心的方法收集。

電鏡下可見早期凋亡細胞的核染色體發生邊緣化，在細胞核膜周邊聚集形成新月體形；稍后由于染色體發生固縮，電子密度增強；核碎裂時則可在胞質中發現多個電子密度增強的核碎片。凋亡細胞體積變小，但細胞器可以保持完好。線粒體完整，但可以輕度腫脹。細胞膜完整，表面微絨毛和尾足減少或消失。細胞凋亡的晚期，可見膜包裹的凋亡小體。

    (二)熒光顯微鏡和激光共聚焦技術

    熒光素是一種染料，在一定波長的激發光(excitation)激發下，可以發射(emission)另一波長的光，并被熒光顯微鏡所接收。某些熒光素可以和組織或細胞內特定的結構結合，因而可以用來檢測其含量、結構和分布的變化，并推測細胞的功能狀態。被熒光素標記的組織／細胞切片可以在熒光顯微鏡或利用激光共聚焦技術進行分析。與熒光顯微鏡相比，激光共聚焦技術可以對細胞或組織進行斷層掃描，分辨率更高。同時，還可以通過計算機將斷層掃描的圖像合成三維結構，提供更全面的技術資料。熒光顯微鏡與攝像技術聯用還可以定時記錄被觀察樣品的動態變化過程。將標記的細胞被處理成細胞懸液，還可以用流式細胞儀進行檢測。

注：FLICA 表示capase熒光染料抑制物(fluorchrOme inhibitOr of caspases)