ACQUITY UPLC H-Class 系統提供了擴展批處理肽譜圖分離的精確性和重現性。
目標
測定 ACQUITY UPLC ? H-Class 系統在長淺洗脫梯度應用中的分析可重現性，以解析復雜的混合物，例如肽圖譜分析。
背景
肽譜分析用于確認某種蛋白質的一級結構，識別翻譯后修飾（ PTM ），并分析潛在的雜質。任何蛋白質結構差異應反映在含有該修飾的肽保留時間的變化中。含有和不含有特殊修飾的肽段的相對數量被用于測定含有該修飾的特定樣品中的蛋白質的比例或含量。
面積比例的變化對應于含有特定修飾的樣品中的蛋白分子的含量。為滿足這些應用要求，需要采用長淺梯度洗脫。過去這些分離條件對于單泵梯度系統是一項挑戰。本研究中，我們在 ACQUITY UPLC H-Class 系統上測試了一種典型的肽譜分析方案。 
圖 1. 肽段作圖樣品列表開始于星期五，并在整個周末自動運行在星期一工作人員回到工作崗位時，數據已經準備好接受復查。圖中顯示了每三項分離，表現出了優異的重現性，分辨率和保留時間。如同表格 1 中的概括，五個做標記的峰，從 A 到 E ，被選為定量分析的代表。
溶液
ACQUITY UPLC H-Class 系統由四元溶劑管理器（ QSM ），流量通過針頭樣品管理器（ SM-FTN ），柱加熱器，以及光電二極管陣列（ PDA ）檢測器。安裝了可選擇的 250μL 混合器。 MassPREP TM BSA 試劑中的標準肽段溶液經過 ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 反相柱分離。當每增加一個床體積的洗脫體積，洗脫梯度增加 1.0% ，每分鐘梯度增加約為 0.6% ，此梯度被選為典型多肽作圖梯度。
該方案充分利用了儀器的自動混合能力。純溶劑儲液器和濃縮修飾劑儲備被用于替代二元，經預處理的溶劑。在本例中，梯度是在線路 A 中的純水和線路 B 中的純乙腈中形成，而一部分的液流從含有 1%TFA 的水儲液器 D 中抽取。在梯度中，線路 D 的比例從 5% 降低到 4% ，相當于 TFA 濃度從 0.05% 降低到 0.04% ，從而使得基線漂移最小化。
肽譜圖顯示于圖 1 ，表格 1 中統計分析了保留時間和峰面積等參數。相對保留和分辨率在長系列運行期間保持恒定。保留時間是充分可重現的，以保證峰始終能被正確識別。以峰 A 的面積作為參比，比較峰 B 、 C 、 D 、和 E ，計算各測試樣中其相應比例。在各測試樣中這些面積比例均高度一致（如表格 1 ），這樣的精度符合我們在系列樣品中測量修飾蛋白質的比例的要求。
表格 1. 色譜峰保留時間和面積比例的總結。選作定量比較的 5 個峰，在整個洗脫梯度中均均勻間隔 10min 。
總結
對于有意義的肽段作圖，同時需要定量和定性的可重現性。 ACQUITY UPLC H-Class 系統為大樣品的肽段作圖分離提供了精準的控制，使得分析師對儀器充滿信心，相信任何保留時間的偏差均說明樣品組成發生了變化，而不是由于儀器可變性引起的。在利用了這一多溶劑混合能力時，經觀察的分離符合這一目標。這一系統的設計確保定量和定性結果均符合現代分析生物化學的要求 .