使用Agilent Femto Pulse系統對用于生物樣本庫樣品的基因組DNA進行質量評估
作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda
摘要
核酸樣品的質量保證和質量控制對于生物樣本庫和進行基因組相關操作的實驗室以及多種分子生物學應用必不可少。革命性的 Agilent Femto Pulse 系統是唯一一款能夠替代脈沖場凝膠電泳分析高分子量 (HMW) gDNA 的儀器。Femto Pulse 系統為研究人員提供了極高的靈敏度和快速的分離時間，能夠在 70 分鐘內對單個細胞量的 gDNA 進行定量和鑒定。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒設計用于分離 HMW gDNA，可實現可重現的分子量測定、定量分析和基于基因組質量值 (GQN) 的質量控制評估。
前言
DNA 完整性的表征對于生物樣本庫質量控制評估至關重要。了解基因組 DNA (gDNA) 質量是 DNA 完整性的獨特價值， 并對下游過程的成功必不可少。隨著人們對長讀長和全基因組測序技術、比較基因組雜交以及使用 linked reads 的序列組裝技術的興趣日益增加，了解 gDNA 質量、片段化、分子量分布和濃度成為了成功獲得結果的必要條件。
通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評估 gDNA 質量。影響樣品質量的幾個因素有：樣品儲存、提取方法、反復凍融和變性[1]。在提取和處理 gDNA 期間，DNA 可以在許多不同位點發生物理、酶促和化學剪切，變為小片段。物理剪切發生在長時間的劇烈混合條件下，以及反復凍融和冰晶形成期間。DNA 周圍細胞環境的破壞將通過自由基氧化、脫嘌呤和 gDNA 的核酸酶降解引發酶促和化學剪切，導致一系列短片段的生成。在使用高強度化學品提取 DNA 時也可能發生化學剪切。用大口徑移液槍頭緩慢混合可以防止 gDNA 物理剪切，而通過冷凍、脫水或添加螯合劑（如 EDTA）可避免化學和酶促剪切過程。考慮到 DNA 完整性會以多種方式發生改變，建議在長期儲存 gDNA 樣品之前記錄核酸質量。
通常用過夜脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 分析分子量超過 50 kb 的 gDNA。配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Agilent Femto Pulse 系統是市場上唯一能夠替代 PFGE 評估高分子量 (HMW) gDNA 的解決方案。分離過程在短短 70 分鐘內完成，節省了確定樣品質量所需的時間和金錢[2]。此外，安捷倫設計的 ProSize 數據分析軟件可以通過基因組質量值輕松分析 gDNA 質量。用戶可針對其特定應用設定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據高于分子量閾值的樣品總測量濃度分數計算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級對樣品進行評分，0 表示樣品均未超過分子量閾值，10 表示 100% 的樣品高于分子量閾值。
實驗部分
在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒 (FP- 1002-0275) 的兩臺不同 Femto Pulse 系統上分離 40 號（gDNA 樣品 1）和 92 號（gDNA 樣品 2）Coriell 樣品，以證明儀器間一致性以及隨時間推移的降解程度。在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統上對來自 PacBio 的剪切 gDNA 進行分離，以展示 GQN 指標的靈活性。在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統上對 Promega 人 gDNA (#G1521) 進行分離，以顯示峰大小和特征片段長度。
結果與討論
分子量測定
Femto Pulse 系統利用脈沖場方法分離高分子量
gDNA，用于確定大于 50 kb 的 gDNA 的平均分子量。此外，電泳圖提供了直觀的樣品分子量分布圖。在不使用脈沖場方法的情況下，大于約
50 kb 的樣品顯示為尖峰且測定分子量超過 60 kb。在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統上分析
gDNA 樣品 1，彌散條帶平均分子量為 44800 bp，分布在 1200 到 300000 bp 之間（圖 1）。
儀器間的一致性
在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統上分析兩種不同的 gDNA 樣品。在兩臺不同的 Femto
Pulse 儀器上對幾種濃度下的兩個樣品進行了分析，以證明較大濃度范圍內不同儀器之間的分子量測定、濃度定量和 gDNA
質量分析的可靠性與一致性（圖 2）。每臺儀器各稀釋比例的分子量測定和定量分析精度（誤差）分別低于 8% 和
16%，均處于試劑盒的規格范圍內。此外，GQN 證明儀器有極高精度，CV 為 3%。