實驗概要
本實驗用以血小板內皮細胞粘附分子（PECAM或CD31）為靶分子的活性篩選技術分離和培養純的人毛細血管內皮細胞。
實驗原理
PECAM是130kDa內膜糖蛋白，屬于細胞粘附分子的免疫球蛋白超家族。該分子在細胞中呈組成型表達，基本上為內皮細胞和血小板所獨有，只有一些骨髓譜系的亞種例外。PECAM在骨髓細胞或血小板上的表達不會干擾內皮細胞的分離，因為這些細胞在體外不穩定或不吸附。內皮細胞的任何特性，只要是組成型的和胞外的，都可用于順磁波珠活性篩選。
主要設備
準備下列器械并消毒（高壓滅菌，或者可能的話一次性使用）；
1. 大剪刀（2把）
2. 刮刀（2~3把）
3. 胰蛋白酶消化的燒瓶（每30g絞碎樣品一個）
4. 帶接液器的250uM鋼篩網
5. 15ml和50ml離心管
實驗步驟
1. 分離組織樣品。所以操作在層流柜中進行。
1) 從腹整形樣品分離
a. 解剖樣品，去除任何皮膚、筋膜、肌肉等，只保留脂肪組織。稱重樣品，每10g分裝一份。如果樣品量很大，組織可在4℃儲存24h，可成活毛細血管內皮細胞數有中等程度下降，但尚可接受。
b. 在無菌盤上，用剪刀將樣品剪碎。
c. 用60ml注射器（不帶針頭）吹吸樣品，反復3次或直至樣品充分液化。
d. 取20ml組織放入裝有20ml PBS的50ml離心管，混勻，700r/min離心5min洗出血水相，重復操作，直至樣品相對無血。如果樣品有脂肪組織，移走脂肪層之前的所有步驟必須在室溫操作，以保持其流動性。
2) 從吸脂樣品分離
a. 置真空包裝樣品于篩網上，用含0.5ug/ml兩性霉素和200IU/ml慶大霉素，200ug/ml鏈霉素的PBS反復沖洗。沖洗過程中用刮刀在被沖洗無周圍攪動，輔助沖洗。
b. 取20ml組織放入裝有20ml PBS的50ml離心管，混勻，700r/min離心5min。吸掉含血水相。
2. PBS溶解BSA至終濃度4.0mg/ml（PBS/BSA）；過濾除菌。配制膠原酶溶液，PBS/BSA溶解膠原酶和DNA酶，終濃度分別為4.0mg/ml和0.02mg/ml，0.2uM濾膜過濾除菌。
10ml溶液大約可以處理10ml脂肪樣品。
BSA
膠原酶A（膠原酶應反復試驗，以尋找最佳分離濃度。經驗表明，胰酶活性低的膠原酶似乎能更好地作用于脂肪組織）
DNaseI
3. 用無菌刮刀把步驟1中剪碎的脂肪組織刮到胰蛋白酶消化的燒瓶中，然后加入膠原酶，每ml組織加1ml。
4. 37℃ 80r/min旋動保溫30min。注意觀察樣品溶解程度，若30min后只有少部分組織未溶解，繼續下一步。想法則繼續消化，每隔5min觀察一次。再消化時間盡量不超過15~20min。
5. 消化的同時，用PBS稀釋PBS/BSA（4.0mg/ml BSA）至BSA終濃度0.2mg/ml。消化過程是準備磁珠的最佳時間。
6. 消化樣品倒入50ml離心管（每管約20ml）。
7. 吊筒式醫用臺式離心機室溫1500r/min離心5min。
8. 液態脂和水相倒入另一50ml離心管。由于細胞沉淀極易被倒掉，最好使用無菌離心管。細胞沉淀略帶紅色，易見。若樣品消化過度或膠原酶中胰酶活性偏高，樣品水相由于含有斷裂核酸會很黏。消化緩沖液中加入DNA酶可去除部分核酸，但溶液可能仍有一定粘度。液相粘度高，傾倒時也會帶出細胞，棄掉上清時旋動有助于保留細胞沉淀。
9. 細胞重懸于5ml PBS（0.2mg/ml BSA），1500r/min離心5min，倒掉上清。沉淀懸于1ml含5%FCS的PBS（PBS/FCS）中。此時的樣品已可用于篩選內皮細胞。若消化樣品中留有任何筋膜，連接組織或其他成塊的物質，用磁珠篩選前都需吸掉，此時的樣品應是均一溶液。
10. 偶聯抗 PECAM抗體的磁珠的制備
磁珠一旦偶聯于抗體并經漂洗，可穩定貯存數周。但我們建議在分離步驟中用新制備磁珠，而在后面的傳代過程中用貯存的磁珠篩選。
1) 短暫振蕩，使磁珠溶液均一。
Amac磁珠
株數：每毫克2.5×108珠
結合能力：每毫克珠結合50ug IgG
濃度：10mg/ml
羊抗鼠IgG包被的順磁玻珠
2) 用PBS稀釋PBS/BSA（4.0mg/ml BSA）至BSA終濃度0.2mg/ml。
3) 取100ul磁珠（1mg）加2ml含0.2mg/ml BSA的PBS（20倍稀釋磁珠混合物）。混勻，用鈷-釤磁體分離樣品。
4) 棄上清，沉淀懸于100ul PBS（含BSA 0.2mg/ml）。
5) 磁珠偶聯抗PECAM抗體。
抗人CD-31（PECAM）單克隆抗體(M0823，克隆JC/70A，Dako）
特異性：抗人CD31
蛋白濃度：15.2mg/ml
鼠IgG濃度：260μg/ml
溶劑：IgG1, kappa
抗生物素蛋白/生物素作用
a. 每毫克磁珠加5μg IgG，PBS/BSA（0.2mg/ml）調節體積至200μl。
b. 室溫保溫15分鐘。
6) 用磁體從上清中分離磁珠，棄上清。每毫克磁珠加3ml PBS/BSA（0.2mg/ml BSA），4℃可貯存數周。
11. 偶聯了抗PECAM抗體的磁珠篩選細胞
用偶聯于順磁磁珠的抗體篩選內皮細胞特異抗原PECAM，從污染了非內皮細胞的樣品中分離純種內皮細胞。
1) 向步驟9的細胞樣品中加入30μl偶聯了抗PECAM抗體的磁珠。
2) 細胞和磁珠混合物冰上保溫15min。
3) 磁體置于管側5min，吸引篩選樣品向磁體移動。小心吸棄上清，移開磁體。
4) 向磁珠中加2ml PBS/FCS，輕輕混勻，確保沒有大的團塊。用磁體重復篩選。
5) 重復步驟3和4三次。
6) 磁粒懸于1ml接種培養基中。
接種培養基
M199 培養基w/Earles鹽（M199E)
20% FCS
補加
90μg肝素
70μg內皮細胞生長素
100IU/ml慶大霉素
100μg/ml鏈霉素
7) 重懸細胞接種明膠包被的T25板，每10g脂肪組織分離的細胞接種一塊T25板，37℃振動培養。用1%明膠（溶于PBS）37℃預包被T25瓶2h以上。
8) 細胞長至足夠密度時傳代，在最初的兩次傳代中要應用篩選程序，確保內皮細胞純度。