克隆中載體的處理和去磷酸化

克隆成功與否,除與連接方式以及載體選擇有關外,載體的處理也是一個重要環節。為了提高連接效率,處理載體時應注意以下幾點:

(1)應加入常用量5~10倍的內切酶水解載體,以保證載體被完全酶切;

(2)如用雙酶切割載體,則必須電泳回收載體片段,除去雙酶切所產生的小DNA片段;?(3)如粘端連接,單酶切處理過的載體必須用

堿性磷酸酶

(如牛小腸堿性磷酸酶,CIP)處理,防止載體自身環化。

CIP

可以水解掉DNA5末端的磷酸。對于3末端突出的DNA(如

〖WT5BX〗Pst〖WT5BZ〗I水解,需用10倍于5末端突出DNA(如〖WT5BX〗Eco〖WT5BZ〗RI,〖WT5BX〗

Hin〖WT5BZ〗dⅢ)的CIP進行去磷酸化,以達到最少的載體自身環化。

去磷酸方法如下:

①DNA加入10倍去磷酸化緩沖液,5端突出的DNA,每100pmol 5?磷酸基團加入1個單位的CIP,37℃反應30分鐘。平末端或3端突出的DNA,每2pmol 5?磷酸基團加1個單位CIP,37℃保溫15分鐘后,再加CIP,55℃反應45分鐘(2μg 5kb的線性DNA約含14pmol左右的5磷酸基團);

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分別至終濃度05%、5mmol/L和50μg/ml,混勻后56℃反應30分鐘;或加EDTA(pH8.0)至終濃度為5mmol/L,65℃保溫1小時或75℃,10分鐘滅活CIP;

③冷卻至室溫后,加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次;

④乙醇沉淀,離心,抽干,溶于無菌去離子水,濃度最好為100μg/ml,-20℃保存備用。〖HT5H〗 10倍CIP去磷酸化緩沖液:

〖HT〗〖JZ(Z〗10 mmol/L ZnCl?210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris·HCl,pH8.0。