免疫共沉淀試劑配制及技術路線

實驗概要

本實驗介紹了免疫共沉淀所需試劑配制及操作步驟。

主要試劑

1. RIPA Buffer配制
基礎成分：
Tris-HCl(緩沖液成分，防止蛋白變性)
NaCl(鹽份，防止非特異蛋白聚集)
NP-40(非離子去污劑，提取蛋白；用H₂O配制成10%儲存液)
去氧膽酸鈉(離子去污劑，提取蛋白；用H₂O配制成10%儲存液；避光保存)
注意：準備激酶(致活酶)實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失。
RIPA蛋白酶抑制劑
苯甲基磺酰氟(PMSF)(用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存)
EDTA(鈣螯合劑；用H₂O配制成100mM的儲存液，PH7.4)
亮抑酶肽(Leupeptin)(用H₂O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存)
抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H₂O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存)
胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存)
RIPA磷酸(酯)酶抑制劑
激活的Na₃VO₄(用H₂O配制成200mM的儲存液)
NaF(200mM的儲存液，室溫保存)
注意：在準備做磷酸(酯)酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑
2. 工作液配制
配制100ml的modified RIPA buffer：
   1) 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4
   2) 加10 ml 10%的NP-40
   3) 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清
   4) 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
   5) 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入(抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑各100 μl; PMSF，Na₃VO₄，NaF各500 μl)，但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。
各種成分在工作液中的終濃度： 
      a. Tris-HCl：50 mM，pH 7.4
      b. NP-40：1%
      c. 去氧膽酸鈉：0.25%
      d. NaCl：150 mM
      e. EDTA：1 mM
      f. PMSF：1 mM
      g. 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑：各1 μg/ml
      h. Na₃VO₄：1 mM
      i. NaF：1 mM

實驗步驟

準備工作：
1. 預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子(用保鮮膜包好后，埋冰下)，離心機；
2. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS；
3. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/10⁷個細胞、10cm培養皿或150cm²培養瓶，0.5ml/5×10⁶個細胞、6cm培養皿、75cm²培養瓶)；
4. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min(EP管插冰上，置水平搖床上)；
5. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中；
6. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；
7. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%)，4℃搖晃10min(EP管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景；
8. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子；
9. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月)；
10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)；
11. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異；
12. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育；
13. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl“過渡抗體”(兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG)；
14. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS；
15. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)；
16. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。
通過免疫共沉淀確定結合蛋白：
1. 用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；
2. 將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min；
3. 收集上清(約30 ml)并加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h；
4. 加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min；
5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。最后，用NETN洗一次；
6. 吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min；
7. 將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜；
8. 通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶；
9. 從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；
10.用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫；
11.通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。