免疫沉淀(IP)

實驗概要

免疫沉淀是一種純化蛋白質的方法。將我們感興趣的一種蛋白質的抗體與細胞提取液孵育，以使抗體和蛋白質在溶液中結合。然后用protein  A/G 耦合的瓊脂糖凝膠，從樣品中將抗體/抗原復合物提取出來。這種物理方法可將所需蛋白質從樣品中分離。然后樣品可以通過SDS-PAGE  進行分離并做 Western blot 分析。

實驗步驟

1. 裂解

1) 培養細胞的裂解

         a. 將細胞培養皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗滌細胞。

         b. 吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（1 ml 每 10⁷ cells/100 mm²培養皿/150 cm²培養瓶，0.5 ml 每 5 x 10⁶ cells/60 mm²培養皿或 75 cm²培養瓶）。

         c. 用預冷的塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下，然后輕輕將細胞懸液轉移到預冷的 EP 管中。

         d. 4 °C 持續振蕩 30 分鐘；

         e. 放入微型離心機 4 °C 離心；您可能要根據細胞的類型更改離心力和時間。推薦是 12000 rpm 20 分鐘，但是這必須由最終用戶決定（如白細胞需要輕度離心）。

         f. 從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。將上清液吸出轉移到預冷的新管（放在冰上）中，棄沉淀。

2) 組織裂解

         a. 用干凈器械解剖所要的組織，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

         b. 將組織放入圓底離心管中，浸入液氮中“速凍”。樣本在 -80 °C 儲存備用或放在冰上立即勻漿。

         c. 對于約 5 mg 組織，向管中迅速加入約 300 μl 裂解液并用電動勻漿器勻漿。

          d. 裂解液沖洗刀片兩次，每次 300 μl，然后 4 °C 持續振蕩 2  小時（將回旋振蕩器放入冰箱）。裂解液的體積根據組織總量來決定。蛋白提取物不宜過于稀釋，以避免蛋白質損失，并盡量減少樣品體積以便凝膠上樣。最小濃度為0.1  mg/ml；最佳濃度為1-5 mg/ml。

         e. 微型離心機 4 °C 12000 rpm 離心 20 分鐘。從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。吸出上清液放入預冷的新管（放在冰上）中，棄沉淀。

2.  裂解物預清除

1) 1 ml 裂解物中加入 50μl 同種動物來源和型的無關抗體或正常血清作為免疫沉淀抗體（一些研究人員首選兔，參考 Harlow and Lane，243 頁），在冰上孵育 1 小時。

2) 加入 100 μl 珠漿。

3) 4 °C 孵育 10-30 分鐘并輕輕攪拌。

4) 微型離心機 14000 g 4 °C 離心 10 分鐘。

5) 丟棄珠子并保留上清進行免疫沉淀。

為了提高收率，珠子可用裂解液洗滌 1 或 2 次以上，并將上清收集在一起。

3.  免疫沉淀

1) 在冰上預冷離心管中加入 10-50 μg 含推薦量抗體的細胞裂解物。具體數量將根據蛋白質的豐度和抗體與蛋白質的親和力來選擇。通常在預實驗中，通過增加抗體的量沉淀固定數量的蛋白質。

2) 樣品和抗體孵育的固定時間 4 °C 1-12 小時（過夜），最好輕輕振蕩或旋轉。孵育時間的長短取決于蛋白質的量和抗體的親和特性。

3) 同時準備瓊脂糖珠子。如果使用單克隆抗體，選擇  protein G 偶聯瓊脂糖珠子。如果使用多克隆抗體，protein A 偶聯瓊脂糖珠通常是適合的（請參閱“選擇蛋白珠”表 9.1.5  下文）。如果買來的珠子是粉末，100 mg 的珠子與 1 ml 0.1 M PBS 孵育，洗 1 小時后珠子膨脹起來，然后離心，去除上清。加入 1  ml 含 0.1% BSA（牛血清白蛋白）PBS，混合 1 小時，PBS 洗滌 2 次。去除上清并加入 400 μl  含蛋白酶抑制劑的緩沖液（可與裂解液相同）就可以使用了。它可以在 4 °C 儲存幾天；在含 0.02 % 疊氮鈉的 PBS  里會保存更長時間（使用當天配的新鮮裂解液充分洗滌珠子）。您也可以購買事先膨脹好的珠子直接使用。

4) 最后，去除最后一次上清并加入 25-50 μl 2 X 上樣緩沖液。95-100 °C 煮沸 5 分鐘，以變性蛋白并將其與 protein- A /G 珠子分離，隨后離心并保持上清含有蛋白。然后，您可以凍存樣品或進行 SDS - PAGE 電泳。