石蠟切片免疫組化染色步驟
1、載玻片的處理：
抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50 比例丙酮稀釋的APES 中，停留20~30 秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2 分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC 烤箱烘烤一小時，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10 比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5 分鐘，60oC 烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40 分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180 分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10?g/ml 的saponin 溶液，消化時間為室溫孵育30 分鐘。
3、抗原熱修復：
可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH 值在6.0 ±?0.1，如因蒸餾水本身造成的pH 值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2 處理10 分鐘，蒸餾水洗2 分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15 分鐘（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20 分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS 洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6 分鐘后），計時1~2 分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS 洗2 分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方
法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20 分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30 分鐘，蒸餾水沖洗，PBS 洗，下接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟：
（以美國ZYMED 公司SP 試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 分鐘，(如需采用抗原修復，可在此步后進行)。
5~10％正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10 分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小時或4℃過夜。
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃孵育10~30 分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30 分鐘。
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS 稀釋），37℃孵育10~30 分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30 分鐘。
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次。
顯色劑顯色（DAB 或AEC）。
自來水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片4~8?m，室溫放置30 分鐘后，入4℃丙酮固定10 分鐘，PBS 洗，5 分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10 分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
PBS 洗，5 分鐘×2。
下接免疫組化染色操作步驟。
幾種溶液的配制方法
1、PBS:
取ZLI-9061 PBS 溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，測pH 值應在7.2~7.4 之
間，若偏離此范圍，請用0.1N 的HCL 或NaOH 調整。
2、TBS：
2.1 Tris 緩沖液配方：（0.5 M pH7.6）
Tris（三羥甲基氨基甲烷） 60.57g
1N HCL 約420ml
雙蒸水 加至1000ml
Tris 緩沖液配制方法：
先以少量雙蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）將pH 調至7.6， 最后雙蒸水加至1000ml。此液為儲備液，4℃冰箱中保存。
2.2 TBS 配方：
Tris-HCI 緩沖液（0.5M
pH7.6）
100ml
NaCI 8.5~9g
(0.15mol/L)
雙蒸水 加至1000ml
TBS 配制方法：
先以少量雙蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl 緩沖液，最后加雙蒸水至1000ml，充分搖勻。
3、枸櫞酸鹽緩沖液（Citrate buffer）：
3.1 儲存液：
A. 0.1M 枸櫞酸溶液：稱取21.01g 枸櫞酸（C6H8O7?H20）溶于1000ml蒸餾水中。
B. 0.1M 枸櫞酸鈉溶液：稱取29.41g 枸櫞酸鈉（C6H5Na3O7?2H20）溶于1000ml蒸餾水中。
3.2 工作液：
取9ml A 液和41ml B 液加入450ml蒸餾水中，溶液pH 值應為6.0±0.1
4、胰酶（Trypsin）：
4.1 ZLI-9011 胰蛋白酶消化液：
常用濃度為0.125%，即使用前將一滴試劑1胰酶溶液和三滴試劑2胰酶稀釋液均勻混合（1:3稀釋），則可直接滴加使用。胰酶的最終濃度可以根據使用者的要求進行調整，濃度范圍可以從0.05%（1:10稀釋）至0.25%（1:1 稀釋）。
4.2 ZLI-9010 胰蛋白酶：
取0.05g 或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1% pH7.8 的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可。
5、胃酶（Pepsin）：
4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL 配制。
6、DAB：
6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit：
使用前只需將試劑盒提供的A、B、C 三種試劑各一滴加至1ml 雙蒸水中，即可獲得1ml DAB 工作液，簡單易用。
6.1 ZLI-9030 DAB：
6mgDAB 溶于10mlTBS（0.05M pH7.6），再加入0.1ml 濃度為3％的H2O2，過濾掉沉淀物，即可。
7、AEC：
4mg AEC 溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 濃度為0.1M 的醋酸緩沖液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，過濾掉沉淀物。
8、RIPA：
1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液體可長期保存）。以下抑制劑以儲存液方式保存，臨用前加入RIPA中。
8.1 10mg/ml PMSF 異丙醇溶液（用量為10?l/ml）
8.2 Aprotinin（Sigma 產品，用量為30?l/ml）
8.3 1000mM sodium orthovanadate 冷凍液（用量為10?l/ml）
9、Blotto A：
常規使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。
10、Blotto B：
與Phosphotyrosine抗體共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分實驗中milk 可完全去除，但可能引起背景增高。
免疫組化常見問題的處理當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應系統地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。
對照/標本無染色
① 確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③ 對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM 一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥ 檢查標本的儲存條件，最好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦ 檢查色原/底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。
⑧ 檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH 值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨ 檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：
① 標本的固定方式，不當的固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。
② 不適當的抗原修復方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。
③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。
④ 切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
非特異性染色
① 是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是，并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為：
滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH 值在7.6~8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L 的酒石酸抑制。
飽和處理內源性生物素：
消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩余的結合位點。具體方法是__________在ABC 法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15 分鐘，PBS 清洗15 分鐘后即可染色。
② 是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS 稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區亦極重要。最近有些國內的實驗室應用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。
③ 所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
④ 一抗的使用濃度是否過高。
⑤ 清洗是否充分。應嚴格操作規程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數染色方法，溶液內加入吐溫20，效果更佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。
⑥ DBA 的使用是否正確。DAB 的孵育時間和配制方式可以產生某些背景顏色，使用濃縮型DAB 試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH 值，以確保實驗結果的正確性；粉劑DAB 溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB 保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB 保存于避光干燥處，現用現配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。
⑦ 標本染色過程中是否曾經干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。
⑧ 檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。