LUMA介紹
基因組DNA甲基化(Genomic DNA Methylation, GDM)的變化被認為是正常和病理細胞過程中的重要的事件，有助于正常發育和分化以及癌癥和其他疾病。在此，我們介紹一種新的方法評估全基因組DNA甲基化，稱為熒光甲基化檢測(Luminometric Methylation Assay，LUMA)。該方法采用甲基敏感限制性內切酶DNA裂解法聯合焦磷酸測序的聚合酶延伸分析。該方法是一種定量檢測技術，重現性高，易于推廣。
其優點是：無需亞硫酸鹽修飾，無需引物，無需PCR過程，測序反應無需磁珠等試劑，十分鐘左右即可完成測序反應，方便快捷。而且，該實驗只需要200-500 ng的基因組DNA，并包含一個內控以消除起始DNA數量不同的問題。整個實驗過程能夠在6個小時內完成。
技術原理
此方法由Karimiet等人于2006年建立，采用DNA甲基敏感或不敏感的限制性內切酶進行DNA裂解，隨后進行生物熒光聚合酶延伸試驗，以定量限制性裂解的程度。此實驗使用了對CpG甲基敏感的限制酶HpaII及其對甲基不敏感的同裂酶MspI做平行反應。EcoRI被用在所有反應中作為內參。
MspI和HpaII酶切靶序列為CCGG，其CpG位點數量占整個基因組中CpG位點的8%，可以作為評估全基因組甲基化水平的一個標志物。MspI和HpaII裂解后形成5’CG粘末端,而EcoRI生產5′AATT粘末斷,然后通過聚合酶延伸逐步填充苷酸。隨著dNTP的成功延伸，無機焦磷酸(PPi)被釋放并通過ATP硫酸化酶和5’磷酰硫酸腺苷（APS)作用下轉化為ATP。隨后熒光素通過熒光素酶和ATP產生一定比例的可見光并由CCD檢測。
實驗步驟
1. 酶切：每例樣本分為2份DNA，分別用HpaII+EcoRI或MspI+EcoRI雙酶切，酶切約4hr。
2. 純化：酶切產物純化回收。
3. 焦磷酸測序（Pyrosequencing），反應過程如下：
dNTPs按四個步驟添加(步驟1:dATPαS,第二步:dGTP + dCTP,第三步:dTTP和步驟4:dGTP +dCTP)。峰值對應dATPαS(步驟1)和dTTP(步驟3)的添加，都代表EcoRI裂解，因此兩者應該是等值的。因此,dTTP峰用作dATPαS峰的質控。第2步，dCTP和dGTP一起添加，對應的峰值代表HpaII或MspI裂解。在步驟4中，再次添加dCTP和dGTP作為內控完成第二步，因此其相應的峰值應該是零或接近零。
甲基化率（%）計算：如下圖
甲基化率={1-[HpaII(C+G)/EcoRI(A)]/[MspI(C+G)/EcoR(A)]}×100, 上圖中樣本甲基化GDM=57.12%
技術應用及優化
LUMA法自Karimiet等人建立以后，已經到到廣泛應用，特別是最近幾年表觀遺傳學研究的深入，此法往往配合NGS、甲基化芯片等技術對實驗樣本進行不同層面的表觀遺傳檢測。在應用過程中，該方法也在不斷的被評估和改進。
Carolina Soriano-Ta′ rraga等提出此方法受DNA抽提方法的影響，同一樣品抽提方法 不同得到的甲基化率有差異。但對于同樣抽提方法的樣品來說還是有比較好的使用價值的。
Sofia Lisanti等提出EcoRI內切酶具有“star activity”效應，即非特異性切割（受Buffer濃度和切割時間影響）和切割不充分（對于EcoRI酶切位點GAATTC的甲基化影響酶切活性），所以作者提出使用與EcoRI有類似酶切位點的MunI替代。
Claudia Knothe等人使用MunI同裂酶MfeI作為內控，并且提出峰值計算新公式：即用A峰和T峰的平均值替代原公式中的EcoRI(A)。
參考文獻：
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