六種染色后光鏡觀察法檢測肝癌細胞凋亡

作者：楊連君，司曉輝，王文亮，王文勇，趙一嶺，方正清

［摘  要］ 目的：探討簡便易行的在光鏡下通過形態學觀察檢測細胞凋亡的方法，并對其進行比較。方法：首先用6%的乙醇作用6 h誘導人肝細胞癌細胞系HCC9204細胞凋亡，然后進行未固定細胞的臺盼藍染色、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)雙染色，細胞固定后的Hoechst 33 258熒光染色、MayGrunwaldGiemsa(MGG)染色和常規HE染色等形態學觀察，并進行末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法檢測。結果：用低濃度乙醇誘導細胞凋亡后，大部分肝癌細胞為臺盼藍拒染，TUNEL陽性著色。除了臺盼藍染色法以外，AO/EB、Hoechst33 258、MGG和HE等染色法，以及TUNEL檢測法均能夠不同程度地顯示典型的細胞變圓，細胞核深染，染色質邊集、呈環狀、團塊或新月體狀，以及細胞漿濃縮和“出泡”現象等細胞凋亡的形態學特征。AO/EB雙染色法還能夠顯示呈致密濃染的黃綠色染色或出現黃綠色碎片的早期凋亡細胞，呈致密濃染的鮮紅色染色或出現鮮紅色碎片的晚期凋亡細胞，以及呈鮮紅色膨大狀的壞死細胞。結論：上述六種染色方法均可作為檢測細胞凋亡的手段。除了臺盼藍染色以外，其余5種染色方法均可用于觀察凋亡細胞的形態學變化。其中，從AO/EB雙染色法還可以區分早期凋亡。晚期凋亡和壞死細胞。TUNEL法不僅能夠通過檢測凋亡細胞的DNA片段化來判別細胞凋亡，還可以從形態學上觀察凋亡細胞。

    ［關鍵詞］ 細胞凋亡；檢測；形態學；肝細胞癌

    Detection of Apoptosis in Hepatoma Cells under Optical Microscopic Observation after Stained by Six Methods

    YANG Lianjun1,SI Xiaohui1,WANG Wenliang2,et al

    (1.Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang,Hebei 050082，China;2.Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China)

    Abstract:Objective To investigate some simple and convenient morphological methods to detect apoptosis under optical microscopic observation, and perform contrast study in them.Methods At first, human hepatocelluar carcinoma cell line HCC9204 cells were affected by 6% ethanol for 6 h to induce apoptosis. The nonfixed cells were stained with trypan blue and by the doublystaining method of acridine orange/ethidium bromide (AO/EB),then the cells were fixed and stained with fluorescent dye Hoechst 33 258,MayGrunwaldGiemsa (MGG) and normal H.E stainings, and at last Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining was performed.Results After affected by lowconcentration ethanol to induce apoptosis,most hepatoma cells were negative in trypan blue staining and TUNELpositive.Except for by trypan blue staining， typically morph ologically apoptotic characters such as pyknosis, circled,densestained nucleus and cytoplasm,nucleus granuling,ringing or crescenting,and cytoplasm bubbling in different extent could be seen in the cells stained by AO/EB,Hoechst 33 258,MGG,H.E and TUNEL Besides,early apoptotic cells which were densely green yellowstained or displaying green yellow fragments,late apoptotic cells which were densely cardinal redstained or displaying cardinal red fragments, and cardinal red swollen necrotic cells could be found in the AO/EB doubly stained cells.Conclusions All the above 6 staining methods can be used to detect apoptosis.The morphological characters of apoptotic cells can be observed after stained by all the other 5 methods except for trypan blue staining. Besides detecting apoptosis, early apoptotic cells,late apoptotic cells and necrotic cells can be distinguished by AO/EB doublystaining Not only apoptosis can be detected according to DNA fragmentation, but also the morphological characters of apoptotic cells can be observed in TUNEL staining.

    Key words:Apoptosis;Detection;Morphology;Hepatocellular carcinoma

    細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，在正常細胞的死亡與更新，胚胎組織的生長和發育，腫瘤細胞的發生和發展，以及機體的免疫耐受等許多生理和病理過程中具有重要的意義［1，2］。雖然目前有多種檢測細胞凋亡的方法，但是尚缺乏簡便易行的形態學檢測方法［3，4］。我們以低濃度乙醇誘導人原發性肝細胞癌(以下簡稱肝癌)細胞系HCC9204細胞凋亡，進行未固定凋亡細胞的臺盼藍、吖啶橙溴化乙啶(AO/EB)染色，凋亡細胞固定后的Hoechst33 258、MayGrunwaldGiemsa(MGG)和HE染色等形態學觀察，以及末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法檢測，以探討簡便易行的通過光鏡下形態學觀察進行細胞凋亡檢測的方法。

    1  材料和方法

    1．1  細胞和主要試劑  人肝癌細胞系HCC9204為第四軍醫大學病理學教研室建立，用含10％新生牛血清的RPMI1640(美國Gibco公司產品)培養液，在飽和濕度和5％CO2條件下培養151。Hoechst33 258和EB均為美國Sigma公司產品。AO為美國Amresco公司產品。TUNEL試劑盒為德國BoehrmgerMannheim公司產品。

    1．2  未固定凋亡細胞染色觀察  把處于對數生長期的HCC9204細胞換為含6％乙醇的培養液繼續培養6 h(以正常生長的和經用含10％乙醇的培養液培養6 h后的HCC9204細胞作為正常和壞死細胞對照)，然后進行以下染色和觀察：收集離壁漂浮的細胞，加入終濃度為0．4％的臺盼藍3 min后，細胞滴片于倒置顯微鏡下觀察；將25 Ld離壁漂浮的細胞懸液與2 μlAO染液(100 μg/ml)和2 μl EB染液(100 μg/ml)混合后滴片，立即用熒光顯微鏡觀察。

    1．3  凋亡細胞固定后染色觀察  將生長于蓋玻片上的對數期HCC9204細胞換為含6％乙醇的培養液繼續培養6 h(以正常生長的和經用含10％乙醇的培養液培養6 h后的HCC9204細胞作為正常和壞死細胞對照)，然后進行以下染色和觀察：玻片晾干后用MGG染液染色20 min，光鏡觀察；細胞用95％的乙醇固定后進行常規HE染色，光鏡觀察；細胞經體積比為3∶1的甲醇：冰乙酸4℃固定5 min后，用Hoechst33 258(5 μmol/L)染色10 min，立即用熒光顯微鏡觀察。

    1.4  凋亡細胞的TUNEL法檢測  將生長于蓋玻片上的對數期HCC9204細胞換為含6％乙醇的培養液繼續培養6 h后，晾干并經4％的多聚甲醛固定30 min，置4 ℃的穿透液(含1 g/LTritonX100的1 g/L枸櫞酸鈉)中2 min，用FITC標記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉移酶組成的TUNEL反應液(以PBS為陰性對照)于37 ℃染色60 min，立即用熒光顯微鏡觀察。

    2  結果

    2．1  臺盼藍染色  大部分細胞為臺盼藍拒染，而壞死對照的大部分細胞被染成淡藍色，正常細胞對照中只有個別細胞為臺盼藍著色。

    2．2  AO/EB雙染色  大部分細胞主要呈致密濃染的黃綠色染色或黃綠色碎片(早期凋亡細胞)；部分細胞呈致密濃染的鮮紅色染色或鮮紅色碎片(晚期凋亡細胞)；少部分為鮮紅色的膨大細胞。而在正常對照細胞主要呈細胞核綠色淡染，細胞漿桔黃或桔紅色。壞死對照大部分為鮮紅色的膨大細胞。

    2．3  MGG染色  正常細胞呈細胞核粉紅色，細胞漿淡藍色著色。實驗組的大部分細胞固縮變圓，整個細胞呈深藍色。壞死對照為形狀不規則的淡藍色膨大細胞。

    2．4  HE染色  可見典型的細胞變圓，細胞核深染，染色質邊集、呈環狀、團塊或新月體狀，以及細胞漿濃縮和“出泡”現象等變化。而對照組未見上述變化。

    2．5  Hoechst33 258染色  正常細胞的細胞核為彌散均勻的圓形或橢圓形熒光。實驗組的細胞核或細胞質內可見致密濃染的顆粒、新月體或環狀熒光。壞死對照也可見顆粒狀熒光，但呈松散和淡染狀。

    2.6  TUNEL法檢測  陽性信號為黃綠色或黃色熒光，局限于細胞核內，呈圓形、橢圓形、新月體形或環形。實驗組的大部分細胞為陽性著色。陰性對照中未見陽性信號。

   3  討論

    低濃度乙醇主要對細胞產生兩方面的損傷作用：破壞細胞的線粒體和微粒體電子傳遞系統，損傷細胞合成ATP和激發脂質過氧化的功能，使細胞生物膜流動性改變；導致細胞基因組DNA斷裂，抑制DNA修復酶的功能［6］。我們以往用透射電子顯微鏡觀察發現，低濃度乙醇能夠使HCC9204細胞發生細胞核和細胞漿深染，染色質呈邊集變化。細胞經碘化丙啶染色后用流式細胞儀分析檢測到凋亡細胞的特征性亞二倍體峰［7,8］。因此，本實驗用低濃度乙醇誘導HCC9204細胞凋亡作為凋亡細胞模型。本實驗采用臺盼藍、AO/EB、MGG、HE、Hoechst 33 258和TUNEL染色等6種細胞凋亡檢測方法，從多個角度觀察了低乙醇誘導肝癌細胞凋亡的形態學變化。除了臺盼藍染色以外，其余5種觀察方法基本上概括了凋亡細胞的形態學特征，即細胞固縮、變圓，細胞核和細胞漿濃染，細胞核呈顆粒狀、環形或新月體狀，細胞漿可見“出泡”等現象。說明上述方法對通過光鏡形態學觀察來檢測細胞凋亡都具有一定的意義。AO能夠透過細胞膜，把細胞核內的DNA染成綠色，細胞漿內的RNA呈桔紅色。早期凋亡細胞的細胞膜尚完整，細胞漿發生固縮，細胞核固縮或碎裂，因此呈致密濃染的黃綠色，有的還可見碎塊狀。晚期凋亡細胞的細胞膜通透性增加，EB能夠通過，使其呈鮮紅色固縮體或碎塊。壞死細胞不僅細胞膜不完整，而且線粒體腫脹，為鮮紅色的膨大細胞［9］。本實驗的結果也表明，AO/EB染色法對區分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞具有一定的意義。TUNEL法的原理是利用TdT對斷裂的雙鏈DNA進行末端標記。在細胞凋亡早期對凋亡細胞和壞死細胞的鑒別上，它優于以往采用的DNA聚合酶或Klenow酶催化的原位末端標記技術［10，11］。本實驗結果顯示，大部分TUNEL染色陽性的細胞同時具有明顯的細胞核顆粒狀、環形或新月體狀等凋亡細胞形態學特征，說明TUNEL技術可原位同時顯示凋亡細胞的形態和分布。部分TUNEL陽性的細胞呈圓形或橢圓形，未見明顯的凋亡細胞形態學變化，說明這些細胞可能是處于凋亡早期的細胞，TUNEL法能夠檢測到早期的凋亡細胞。

    參考文獻：

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    解放軍白求恩國際和平醫院，河北 石家莊 050082；   第四軍醫大學，陜西 西安 710032)