根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。
第一型限制酶
同時具有修飾（modification）及識別切割（restriction）的作用；另有識別（recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距離識別位（recognition site）可達數千個堿基之遠。例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶
只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindⅢ。
第三型限制酶
與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24-26個堿基對。例如：HinfⅢ。