1）免疫脾細胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內直接免疫法。
2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處于對數生長期。
3）細胞融合的關鍵:
1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。
4）陽性克隆的篩選 應盡早進行。通常在融合后10天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。
5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應盡早進行并反復篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀釋法。
（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然后進行單細胞培養。這種方法操作復雜，效率低，故不常用。
（2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養細胞。由于第一次克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍保存，以便重復檢查，避免丟失有意義的細胞。
（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。
（4）熒光激光細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然后根據抗原與雜交瘤細胞結合的特異性選出細胞，并進行單細胞培養。
6）細胞的凍存與復蘇
7）大規模單克隆抗體的制備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。