關于密度梯度離心有關問題的補充說明（一）

（一）離心管及轉頭密度梯度制備

① 手工制備；是主要的也是常用的方法

i 階梯形梯度制備：配置不同密度的梯度液（與離心溫度相同），用帶恒溫裝置的阿貝折射儀檢測各密度層折射率用于檢測密度的正確性，按照由濃至稀薄的順序分層鋪在離心管中；再在梯度液上部或底部鋪樣品。

ii 線性梯度手工制備：把連續梯度分成（5～10）段不等密度，按照密度的高一低順序分層鋪在離心管中，根據梯度材料不同而在室溫中靜止存放數小時或過夜；利用梯度材料在重力作用下的濃度擴散形成近線性梯度。

iii    線性梯度凍溶制備；配置平均密度   的等密度液，放在低溫冰箱中凍結（一般過夜或數小時）全部凍結后取出室溫溶化，全部溶化后再放在冰箱中凍結，再靜置溶化后可以形成近線性密度梯度。

② 自制簡單梯度儀制備：取二個直徑相同的玻璃燒杯，請燈工聯接底部，聯通管的   中部加旋塞開關，將最高密度梯度材料和最低密度材料分別置于不同燒杯（注意，二個燒杯中梯度液相加的總容量等于離心管單管梯度液容量）。濃液燒杯中放置螺旋攪拌器，將管道泵的抽出管置于濃杯底部，打開二個杯中間旋塞開關，開動攪拌器及管道泵。抽出至離心管中，直至抽完。這個方法適用于單管容量較大（10ml 以上）的梯度制備、如果管道泵輸出有多管分液器，可以用于多管制備，此時二燒杯容量和籌于多管容量之和。

③ 用廠商提供的自動梯度儀制備可以同時制備單管或多管（多至6 管）。如果盛放梯度液的容器直徑不同則可以制備曲線梯度，（如高濃度杯直徑大，可制備凸指數梯度如低濃度杯直徑大，則可制備凹指數梯度。凸指數梯度可提高高密度區分辨率，凹指數梯度可提高低密度區分辨率）

④ 區帶轉頭及連續流轉頭的密度梯度制備（參考梯度取出第⑦部分說明）

⑤ 利用某些梯度材料在離心過程中自形成梯度的特點制備密度梯度【參考“離心技術講座”文獻第18）】

（二）密度梯度離心后梯度液的取出方法

① 離心管底部穿孔后分滴收集：較大容量注射器針頭倒放在空管中（空管內徑比離心管外徑稍大），離心管順空管柱下用力刺破管底后松管蓋后往下滴液，手工或用計滴（或計時）分部收集器收集后分管作吸光度測量，并繪出容量一吸光度曲線定位。

特點：用于看不清純樣品帶的離心；方法簡單可行；層次間有少量混浠（特別是低密度液體）影響分辨率；離心管一次使用，成本稍高；適用于薄壁PA，PP， PPCO， PET 管，不適用于PC 管、各種厚壁管、金屬離心管及離心瓶；收集后的吸光度測定和容量－吸光度曲線繪制費時、繁復。

② 手工上取：開口管傾斜20°～30°，用定量吸管沿內壁液面處緩緩吸出注入收集管，換吸頭再重復吸出，一層層往下收集。

特點；簡單可行；一般5ml－40ml 離心管可收集成50～100 管，在容量一吸光度曲踐上每收集管有一點。如果梯度離心后會形成三個以上的純樣品帶，收集的管數可能要增加到100~200 管才能給繪成比較完整的峰值曲線，和下部穿孔取樣一樣簡單但是非常繁瑣，工作量很大；適用于各種離心管、厚壁管、或離心瓶，使用熔封密封管、指壓管或快封管時要削去管的肩部以上部分，會影響液柱的整體性。

③ 側壁穿刺取樣：對于可見純樣品帶的實驗（如質粒DNA，染色體DNA，線粒體等）；可將離心管套在一個開有側狹縫的空管中用注射器從側面穿刺進入離心管，緩速抽出。

特點：直接抽出所附要的樣品成份；回收率以80％左右；分辨率取決于操作水平；只適用于薄壁的PE，PA，PPCO，PET 管；離心管一次性使用；不適用于不顯色的樣品。

④ 用特制的取出梯度密封蓋，細管插入管底，從上部用蠕動泵泵入高密度排擠液，從密封蓋上部側向開口排出梯度液。梯度取出是從低密度到高密度依次而出。排出口可以聯接分光計流動池再接分部收集器，也可以用手工分管收集。

特點：用于開口管，不損壞離心管；密封蓋制作比較復什；上部取出次序是從低密度到高密度可以保持較高的分辨率和回收率；一般不用于密封管、快封管和指壓管；梯度取出后的流動池連續吸光度測定和聯接分部收集器可一氣呵成，省時省力。

⑤ 用密度梯度分部制備一收集儀上取：一些廠商提供了自動的多管梯度制備和單管上取收集儀器（如日立的DGF—U），非常適合做開口管的密度梯度上取→分光計流動池吸光度測量→繪制容量→吸光度曲線→自動分部收集的一體化自動取出和測定。自動梯度儀的上取管聯接著液面高度探測器，可以自動地在一邊往上吸的同時吸管往下移動，它附有管道泵，可以在很大范圍內調整抽取速度。

特點：自動化程度高，省時，省力；分辨率和回收率都很好：適用于各種離心管、瓶；用于溶封管，指壓管及快封管時只要削去管肩上部一小部分，基本上不影響液柱的整體性；分光計沒有流動池時也可以手工收集；儀器還可用于多管（1～6 倍）梯度制備；設備投資稍高。

⑥ 用玻璃毛細管慢慢插入管底，毛細管上部聯接蠕動泵軟管用蠕動泵抽出再分部收集，或直接聯向分光光度計流動池連續測量吸光度并同時繪出曲線，峰值所在即為某幾個已純化的樣品所在位置，通過流動池后再用分部收集器或人工收集。

特點：梯度抽出次序是從高密度到低密度，為了減少層間干擾，插入時要緩慢插入和必須緩慢抽出；對各種材料的開口管、厚壁管、離心瓶都可以多次使用（不破損離心管），也可用于快封管、指壓管、熔封管（一次性使用管），抽出前須用刀片切去密封口。由于高密度向低密度的抽出往往會引起離心管內不同層次梯度液的混合，降低分辨率，一般不推薦給初次使用者。

⑦ 轉頭（區帶、連續流）密度梯度離心后梯度液的取出：區帶轉頭的梯度制備、加樣和梯度取出卸樣過程都是在低速運轉情況下實現的（2,000~3,000rpm），由特制的密封加樣一卸樣裝置和密度梯度泵來實現密度梯度液的制備和排出。用管道泵輸入樣品。排出液聯到帶流動池的分光計后由分部收集器收集。部分超速連續流離心產品（如日本Hitachi 的變頻驅動的大容量超速連續流裝置CC－40；美國Alfa－Wasserman 公司壓縮空氣驅動的同類超速連續流裝置KII）可以在靜止狀態下加入梯度液，利用離心機的慢加速把水平梯度轉換成垂直梯度然后轉頭升速至超速（40,000rpm 以下）后連續加樣。離心完成后快減速至低轉速，慢減速完成轉頭內液體的垂直梯度向水平梯度轉換，停轉后從轉頭下部從部泵出梯度液再聯接到分光計流動池檢測后自動分部收集。

（三）離心后梯度物質中純樣品區帶的檢測方法

l 可顯色材料（如加E.B. 的質粒DNA 樣品帶，染色體樣品帶，線粒體樣品帶）的直觀肉眼觀測。

l  某些樣品在紫外光照射下顯色的直觀觀察。

l 分部收集后分別用光鏡或電鏡觀察（如細胞、亞細胞構造，病毒等等）。

l 分光光度計流動池（儀器收集）或標準池（人工收集）吸光度測定，容量一吸光度曲線繪制后根據峰位置定位純樣品區帶所在的分部收集管。一般核酸，核蛋白體檢測用波長260nm；細胞，質膜及亞細胞構造用540nm 都可以獲得滿意的結果。

l 用放射性同位素標記然后用相應的儀器檢測（如液閃計數或γ計數器）。（文獻2）

l 用特定的酶標記（如亞細胞構造，細胞器的內膜等）。（文獻3）