關于密度梯度離心有關問題的補充說明（二）

（四）轉頭、離心管的選擇

l  轉頭選擇：速率一區帶（Rate-Zonal）沉降密度梯度離心：選擇甩平轉頭及垂直管轉頭，大容量選擇區帶轉頭。

l  速率－區帶上浮密度梯度離心，小容量以甩平轉頭為主，大容量用區帶離心轉頭；其他各種型式轉頭（固定角，垂直管，小角度）也可以試用。等密度離心（Isopycinc ）小容量用垂直管轉頭、大容量區帶轉頭是優選；對于生物大分子的等密度離心可選用小角度或固定角式轉頭；對于細胞和亞細胞構造及病毒的等密度梯度離心選用甩平轉頭。（主要選擇轉速在4 萬轉/分、容量6×12～13ml 的甩平轉頭）

l  離心管：選擇可以反復使用，梯度制備和梯度取出都很方便的薄壁開口管為主，（PA 管使用最廣泛）；各種厚壁管、（可以只加一部分樣品，保持最大離心力，縮短離心時間）離心瓶和各種密封瓶為輔。選擇離心管應考慮用什么方法制備和取出梯度；材質耐藥性和消毒方法；選擇何種轉頭、轉速水平及其他因素。要仔細閱讀轉頭樣本上每一個轉頭使用哪些離心管和相應的最高轉速、密封方法，（當然這些問題在選購離心機決定配置時就應該考慮周全）。密封管雖然能用到超離最高轉速（如l0 萬轉/分），但因為只能一次性使用，制備和取出梯度較困難，在使用上受到一定限制。開口管和密封管都必須加滿和密封。厚壁管可以不加滿，某些厚壁管可以在最大容量之內隨意加樣；離心瓶一般加到肩部以上；用甩平轉頭時梯度液和樣品容量總和的液面應控制在管口下3mm，（離心時液面是彎月面，3mm 的空隙在離心時可使管壁處液面距管口1mm，既不會使液體溢出，又保證了液體支撐住離心管壁而不致于在強大離心力作用下向內翻卷）

（五）其他要注意的問題；

l  梯度上（或下、或中）樣品的加樣量：為了提高分離的分辨率以保證純度，加樣量一般控制在離心管實際總容量的2％～5％，濃度高的樣品加樣量少一些，濃度低的樣品加樣量可以多一些，對連續梯度離心都應控制在這過個范圍內。有個例外是使用階梯梯度分離樣品，可以根據實際情況提高加樣量。特別是在區帶轉頭中使用階梯梯度離心。加樣量甚至可以高達轉頭容量的10％～30％（如各種疫苗生產的全病毒或抗原蛋白的純化制備等）。

l  離心溫度的選擇和轉頭預冷：

A：離心溫度選擇的原則是：

（1）    保證被分離樣品的品質（特別是酶類樣品）常用4℃一5℃。

（2）保證重金屬鹽在強大離心場中不產生結晶。常用18℃～ 22℃，使用8 萬轉／分轉速以上時用分時段逐級降速的分步離心法，避免結晶生成。

（3）在使用有機溶劑時要保證低溫不揮發、或少揮發，不產生氣溶膠（當然，也要同時考慮離心管、瓶、適配器和轉頭的良好密封）。

B：梯度的同溫檢測：由于配置的同濃度梯度材料的密度，光折射率和粘性系數、滲透率在不同溫度時都有很大變化。而一般檢驗密度值都用阿貝折射儀，所以折射儀應配有恒溫設備，設定溫度應該與離心溫度相同。

C：轉頭應預冷到接近離心溫度。超速離心轉頭一般不用時都儲存在3℃～4℃冰箱內， 用于18℃～22℃離心應提前一天取出轉頭在室溫平衡。高速離心應事先把轉頭放在冰箱內過夜或在離心腔內低速預冷到接近離心溫度后再加樣。

注意：超速離心轉頭在部分真空中旋轉，與離心腔內壁的傳熱主要依賴熱輻射，在部分真空中對流換熱量很小。依靠輻射傳熱，降溫很慢，所以超速離心轉頭在離心腔內長時間預冷是非常不合理的。超速離心機的制冷系統主要用于抵消在部分真空中高速旋轉的轉頭與稀薄空氣摩擦產生的熱量，而不是用來冷卻溫差很大的轉頭。在任何高、超速離心機實驗室中配備低價值的冰箱是非常合理的。超速離心機在較高真空情況下用紅外測溫可以達到較高的精度（±0.5℃以下）， 而高速離心機在大氣中旋轉或在低真空中旋轉（1/3～1/2 大氣壓），無法準確測定轉頭溫度。如果離心機有溫度自動補償軟件（即直接顯示轉頭溫度），用戶隨時可知道轉頭（接近樣品）的實際溫度。如果用戶使用的是沒有溫度自動補償軟件的離心機，比較合理的處理方法是預冷轉頭。（如果不預冷轉頭，這類離心機顯示的溫度在開始離心的半小時內和轉頭實際溫度相差很大）。

l  防止污染：

A：防止操作過程中接觸樣品的器具（離心管，管蓋，轉頭部件，連續離心或區帶離心的加樣系統。各種密封啳，管道）污染樣品。它們都必須清洗、消毒，操作人必須戴消毒過的手套加樣和卸樣。防止酶類降介生物大分子組分，防止各種細菌、細胞污染被分離的樣品，防止離心管材料與樣品中的溶劑起作用而污染樣品或造成離心管破壞等等。當然，用什么清洗劑要嚴格按照使用說明書或有關資料處理。

B：防止樣品污染實驗室或者對實驗人員造成傷害：－般離心機都不能使用易燃、易爆樣品。但如果必須使用時要考慮降低離心溫度（減少揮發）和確保離心管、瓶、和轉頭的密封，絕對不能讓易爆、易爆氣體擴散到離心腔內。離心有毒、有害樣品（病毒、細菌、某些基因等等）、或樣品中必須添加有害化學品（如生物大分子離心中加E.B.），操作時除了戴手套、面罩、防護眼鏡以外，要特別注意密封操作，離心管加樣頭、手套一次性處理，實驗室內事故沖洗，沖眼設備要齊全。

對毒害樣品的離心，加樣，卸樣，（包括轉頭密封安裝）可以在生物安全柜內進行（超速離心轉頭有非常好的密封性能。即使由于某種原因離心管損壞，密封失效。操作不當等引起毒害樣品漏出離心管但不會漏出轉頭外）。不要把臺式離心機放在生物安全柜內操作。因為生物安全柜有自己特定設計的氣流走向，一臺低溫離心機的制冷系統有多個用于冷卻的風扇，強力的排風會影響生物安全柜的氣流走向。離心管、離心轉頭、或適配器加蓋密封對防止污染，防止氣溶膠擴散有效。離心腔內的毒害性氣溶膠會影響實驗人員的健康。

l 慢加速和慢減速：為了保證梯度的順利轉換，各類密度梯度離心要求離心機有五檔以上的慢加速（0～1000rpm）和五檔以上慢減速門（1000rpm～0）。一般的知識是這種慢加、減速速率的調整適用于固定角式，近垂直（小角度），垂直管和區帶、連續流轉頭，實際上對于直徑稍大的離心管（如直徑大于25px 的離心管）在低速時（800rpm 左右）由于復合向心力的作用（Coriolis 力），快加速、快減速都會加大這個力的影響，從而影響密度梯度的轉換，增寬純樣品區帶寬度。而直徑25px 的離心管容量在0.5ml 以卜，常用的離心管都會因直徑較大而受到復合向心力的影響。所以，所有的離心管直徑較大的轉頭（包括甩平轉頭）對于要求較高的密度梯度離心都要選擇適度的慢加速、慢減速。

l 預置轉速避開離心機的共振區：每臺離心機都有自己的自振頻率，這個自振頻率對不同轉頭各有差別。由于離心機減震技術的逐步完善，新機型在共振區（運轉轉速與自振頻率相同時）的整機振動感覺已較老機型明顯減少，但如果我們把手放在離心機臺面上或用耳貼在臺面上在加減速過程中轉速通過共振區時還是可以感覺到振動或聲音的明顯區別，尤其是對于較大容量轉頭或甩平轉頭，這種感覺更明顯。一般離心機都有幾個共振頻率，設計者往往想通過結構設計和減震器選擇把第一（低速）共振區盡可能降低而把第二或第三共振區提高到高于最高轉速，但對于轉速范圍跨度很大的高速、超速離心機，要達到這個理想狀態是很困難的。在做密度梯度離心實驗時（尤其是低轉速的細胞或亞細胞構造分離）使設定轉速高于（離心時間縮短）或低于（離心時間延長）共振轉速是必要的。對同一轉頭RCF×T(時間)或ω²t 等于常數，離心效果是一樣的。

l 如何看待允許不平衡量：新型的超速離心機由于減震系統的完善；驅動部由于對稱管不平衡引起的震動可在相當程度上被吸收，使得主機機架幾乎感覺不到不平衡引起的震動，而驅動部壽命也會提高。對稱管不平衡要求也由用天平稱重降低到肉眼觀察液面差在5mm 以內就可以進行正常的離心操作。但由于開口管和密封管（溶封管，指壓管，快封管）都要求基本加滿，這個條件沒有意義。對甩平轉頭，液面距管口必須保持3mm 空間；這個條件也沒有意義。對于厚壁管和離心瓶，這個被放松的條件才有實行的可能。實驗結果表明在優良平衡條件下進行密度梯度離心往往有更好的離心效果，操作者可以感覺到在肉眼觀察液面差5mm 運轉條件和更精確的平衡條件下，在通過共振區（主要是低速）時機組振動感覺的差異。

l 梯度材料的純度；一般認為分析純的梯度材料和緩沖液可用于梯度離心，但是問題出在最常用的梯度材料一蔗糖。某些所謂高純度蔗糖也含有原料植物蛋白和酶甚至還含有金屬離子和其他紫外吸收物質。我們可以用活性碳來去除這些什質或者使用純度有保證的蔗糖。

參考文獻：

（1） Miloslav, D. Richard, H “Conditions for density gradient separations”in “Preparative Centrifugation” IRL press OXFORD University press 1992

(2)   Hinton ,R.H. 等“Anal.Biochem.” Vol:56 P.270

(3)   Hames, B,D 等“Preparative Centrifugations”

Appendix 4, PP 369~387 IRL press 1992