關于數字PCR，這些干貨請收好

　　相對于傳統的qPCR而言，數字PCR（dPCR）是一種高度靈敏的存在，能夠實現核酸的絕對定量和稀有等位基因的檢測。這種方法是在PCR擴增之前對樣品進行微滴化處理，將DNA或cDNA樣品分成上萬個微滴，其中每個微滴或不含DNA靶分子，或含有一個或數個靶分子。每個微滴作為一個單獨的PCR反應，利用終點法PCR對DNA進行擴增。在擴增后，分析每個微滴中熒光信號的存在（陽性）或不存在（陰性）。根據泊松分布原理及陽性微滴的比例可確定樣品中靶分子的絕對數量。

　　20多年來，數字PCR技術經過不斷改進，已應用在多個方面，包括定量癌癥標志物、測定病毒載量、區分基因組變異、驗證新一代測序的結果、基因表達分析、轉基因檢測以及環境監測等。盡管這種技術并不復雜，但經驗也是十分重要的。為此，Bio-Rad的專家貢獻出一些寶貴的tips，幫助你開始并優化dPCR實驗。

　　樣品制備

　　使用多少起始DNA

　　DNA起始量將取決于你所用的數字PCR系統。對于Bio-Rad的微滴式數字PCR系統（ddPCR），每孔大約需要1-100,000個拷貝的DNA靶分子。這相當于3.3 pg至350 ng的人基因組DNA。最好是每孔30,000個拷貝。對于其他生物，每個拷貝的基因組大小需要計算。對于很小的基因組，如細菌和病毒，可能需要稀釋幾次，才能達到這個范圍。對于基因表達實驗，起始cDNA的量將取決于目標的表達水平。

　　擴增前濃縮FFPE樣品

　　在處理高度降解的DNA，如FFPE樣品時，可定量的DNA與可擴增的完整DNA之間可能存在比較大的差異。根據經驗，只有40%的FFPE DNA是可以擴增的。因此，加入更多的DNA是一個明智選擇。不過，FFPE樣品通常含有抑制劑，有時加少一點也有好處。因此，為了讓實驗更成功，建議預先濃縮DNA樣品。

　　實驗設計

　　降低升降溫速率

　　如今，熱循環儀的升降溫速率讓人咋舌。不過，PCR反應中的液滴是靜止不動的，降低了正常熱擴散的速率。因此，熱循環儀的升降溫速率應降低至每秒2°C，以確保更均勻的熱傳遞。對于某些檢測，所有液滴的均勻熱循環可以帶來更干凈的數據。

　　修改PCR擴增條件

　　在處理棘手的模板時，可以更改PCR循環條件。

　　? 對于較長的擴增子（> 400 bp），更改兩步法或三步法操作，加入一個1-6分鐘的72°C延伸循環，這取決于擴增子的長度。

　　? 大多數細菌和病毒可直接制成微滴，而不需要樣品制備和DNA分離。將PCR操作的95°C 10分鐘更改為98°C 10分鐘，以便裂解細菌或病毒。

　　? 對于富含GC的模板，嘗試將PCR循環條件從94°C 10秒更改為96°C 10秒，以協助擴增。

　　數據分析

　　尋找真正的陽性樣品

　　為了確定一個樣品是否為真陽性，Bio-Rad有個好建議。根據無模板對照（NTC）來確定假陽性率（FPR）。接著，將每孔的陽性微滴數量乘以3。陽性樣品中陽性微滴的數量至少是FPR的三倍。

　　在檢測稀有的DNA時，可能需要7-10 μg的DNA。如何確定的呢？若要在1000個背景分子中找到一個稀有目標，或0.1%的靈敏度，根據3的規則，你要在3000個背景分子中找到至少3個陽性微滴，才具有統計意義。3000個拷貝的單倍體基因組相當于1500個細胞或10 ng DNA。因此，若要達到0.0001%的靈敏度，需要篩查10 μg DNA。

　　了解誤差線

　　在ddPCR系統中，每孔的誤差線代表了95%的置信區間。如果合并多個孔，如技術重復，將出現兩條誤差線。外側的誤差線代表了這些重復的平均數標準誤差，而內側的誤差線代表了泊松分布的95%置信區間，現在是基于三個孔的微滴總數。

　　更多建議

　　消化樣品

　　當gDNA的用量超過66 ng時，建議使用限制性內切酶來消化。在處理質粒時，消化可將質粒線性化，獲得超螺旋DNA，實現質粒的準確定量。此外，消化對于拷貝數分析也是很重要的，可確保串聯重復的分離。在處理FFPE樣品時，也建議消化，以確保所有降解的FFPE樣品都能消化至相同程度。

　　消化可在ddPCR混合液中直接進行。使用高保真的限制性內切酶，并確保它們不會切割擴增子。如果面對的是特別困難的模板，如富含GC的模板，試試切割四個堿基或六個堿基的內切酶。

　　使用多個參考基因

　　在評估拷貝數變異（CNV）時，特別是癌癥樣品時，必須確保參考檢測穩定在每個基因組2個拷貝。在癌癥樣品中，參考檢測本身往往擴增或缺失。因此，Bio-Rad建議嘗試多個參考基因，并提供4種標準檢測和57種近著絲粒檢測，以確保CNV檢出是正確的。

　　結語

　　如今，科學界要求更高的數據準確性和更可靠的結果，因此，數字PCR等可檢測和定量低濃度核酸的技術就變得越來越流行。在使用數字PCR時，若你在設置實驗、運行檢測和分析結果時不幸遇到問題，以上的建議也許能助你一臂之力。