X線、CT等影像學檢查有助診斷。
惡性畸胎瘤可出現甲胎蛋白（AFP）、β-人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）升高；甲狀旁腺腫瘤患者可以出現血鈣升高；部分胸骨后甲狀腺患者可以伴有甲狀腺激素水平改變；某些類癌可以伴有腎上腺皮質激素分泌異常；成神經細胞瘤或者成神經節細胞瘤需要進行去甲腎上腺素、腎上腺素測定。
X線透視能夠提供腫瘤大小、部位、密度、成分等信息。CT可以區別脂肪、血管、囊腫及軟組織腫塊、明確腫瘤與周圍結構間的關系。增強CT能夠發現心臟大血管的受累情況，已經成為縱隔腫瘤診斷中的常規檢查。CT檢查并不能區分縱隔腫瘤的良惡性，但它有時候能提示腫瘤侵犯鄰近結構或有無胸內臟器的轉移。
CT三維重建技術使得MRI的應用有所減少。但對造影劑過敏的患者更適合MRI檢查。MRI能夠評價軟組織腫瘤的組成，評價神經源性腫瘤對椎間孔和椎管內的影響程度，評價縱隔腫瘤與血管、支氣管的關系。
B超檢查能夠鑒別縱隔內腫瘤系囊性、實質性或混合性，對胸骨后甲狀腺腫、延伸到縱隔內的頸部囊腫以及靠近胸壁的腫塊的診斷有較大幫助。多普勒超聲能夠分辨腫塊內血流的情況，對心包旁腫塊的診斷有一定幫助。經食管超聲（TEE）有利于評價縱隔腫瘤與心臟大血管的關系。
對懷疑腫塊為甲狀腺來源者，131 I或123 I核素掃描有助于明確診斷，對胸骨后功能性甲狀腺腫診斷的敏感性和特異性較高。
正電子發射掃描（PET）可以在早期診斷腫瘤的生物學改變，檢測腫瘤代謝情況，并且能夠評價全身有無轉移灶。
活組織穿刺檢查適用于臨床上高度懷疑惡性淋巴瘤者，或腫瘤巨大、難以切除干凈的情況，以便明確診斷，制訂治療方案。盡可能采取粗針穿刺的方法，避免細針穿刺的不足帶來診斷的困難。隨著腔內技術如經氣管鏡、食管鏡穿刺活檢以及經縱隔鏡、胸腔鏡技術的開展，幾乎能夠完成全部縱隔腫瘤的活檢。但對囊腫、包膜完整的腫瘤一般主張直接手術切除，特別是考慮診斷為胸腺瘤時。