| 實驗步驟 |
第 1 階段：DNA 引物的激酶處理
研究表明很多種 DNA
聚合酶（比如，T7、修飾過的 T7、Taq、Vent、Tth 和 Klenow)具有脫氧核苷酸末端轉移酶（Tdt)
活性（Clark1988;Hu1993)。DNA 聚合酶將 PCR 產物
3'端的核苷酸延伸，這個反應具有核苷酸以及聚合酶的專一性。比如，：Taq DNA 聚合酶產生的 PCR
產物更傾向于按下面形式修飾（+表示延伸；一表示沒有添加核苷酸）。
聚合酶將堿基加到模板上可能并沒有一致性的模式。因此，不能認為所有的
DNA 聚合酶都能夠用來產生平末端 DNA 片段。然而，對于某些 DNA 聚合酶，可以通過 PCR 引物 5'端核苷酸來控制 PCR 產物的
3'端得到哪一種核苷酸（Hu1993;Costa and Weiner1994d)。利用單磷酸化載體進行定向克隆，插入片段的單磷酸化可以通過在
PCR 前激酶處理引物來實現。更好的辦法是，在合成 PCR 引物時通過化學方法添加一個 5'磷酸基團。合成帶有 5'-磷酸基團的 PCR
引物可以保證所有的單鏈 DNA 都被單磷酸化。激酶處理的優點是所有已有的各套引物都能被修飾，從而可以應用于單磷酸化載體的定向克隆。T4
多聚核苷酸激酶處理是一個簡單而又迅速的技術。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP(10 mmol/L)
2. 酶和酶緩沖液
激酶緩沖液（lmmol/L 氯化鎂，100 mmol/LTris-HCl、pH7.5,5 mmol/L 二硫蘇糖醇)
T4 多聚核苷酸激酶（10U)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物（1ug/ul)
4. 專用設備
兩個水浴鍋，預先調到 37°C 和 95°C
二、方法
1. 在離心管中加入如下成分。
激酶緩沖液，10X 3ul
ATP，10mmol 0.5ul
T4DNA 激酶（10U/ul) 1ul
被選引物 5ug
H20 補充到 30ul
2.37°C 溫浴1h。
3.95°C 煮沸反應體系，使 T4DNA 激酶失活。
第 2 階段：PCR 擴增
因為沒有哪個操作指南指出了哪種緩沖條件可以用于各種不同類型的
DNA 引物-模板系統，所以通常要檢測一系列的 PCR 緩沖液。已經有許多 PCR 優化試劑盒可以用來檢測幾種不同的緩沖液成分
[比如，Opti-Prime PCR 優化試劑盒（Stratagene) 和 The PCR
Optimizer(Invitrogen)]。通過改變某些 PCR 緩沖液成分和利用 PCR 熱啟動酶，可以提高 PCR
產物的得率和特異性。另外，加入終濃度為 0.8~1.6mol/L 的甜菜堿，可以提高 DNA 的擴增效率，這是因為甜菜堿可以抑制富含 GC
的區域形成二級結構。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
甜菜堿溶液，PCR 級（Sigma)
dNTP 儲存液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 100 mml/L)
TE 緩沖液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
克隆用的 P/mDNA 聚合酶（Stratagene)
PCR 緩沖液，10X(隨酶一起購得）或者 PCR 優化緩沖液；比如，Opti-Prime PCR 優化試劑盒（Stratagene) 或 The PCR Optimizer(Invitrogen)
熱穩定的 DNA 聚合酶（5U); 比如，Taq DNA 聚合酶，TaqBead 熱啟動聚合酶（Promega)，高保其 Platinum Taq DNA 聚合酶（Invitrogen)，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
模板 DNA(1~50ng 質粒）
4. 專用設備
PCR 儀
5. 額外項目
瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑，包括溴化乙錠
可以選擇：PCR 增強劑，比如，Taq Extender PCR 添加劑（Stratagene)，PCRx 增強系統（Invitrogen)
二、方法
1. 冰上，在一個 0.5 ml(原文為 ul—譯者改）無菌離心管中建立 25ul 體系。按順序加入如下試劑。
10XDNA 聚合酶緩沖液（最終為 1X) 2.5ul
模板 DNA(1~50ng 質粒或者是 105~106 目標分子*） 1~10ul
dNTP 儲存液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 10 mmol/L) 0.5ul
甜菜堿溶液（5mol/L) 2.5ul
上游引物（4ug/ul) 0.25ul
下游引物（4ug/ul) 0.25ul
熱穩定的 DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul
可選擇：Taq Extender PCR 添加劑（5U)(額外的） 0.25ul
H20 補充到 25ul
*對于 3X105 目標：1ug 人單拷貝基因組 DNA;10ng 酵母 DNA;1% 的 M13 噬菌斑。
2. 混合均勻，應該立即進行 PCR 擴增。
3. 在一個有熱蓋的 PCR 儀上進行 PCR(如果沒有熱蓋，應該用礦物油覆蓋反應體系），按下面的建議設定溫度程序。
4. 溫度循環完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物的保真性和得率。1~5ul PCR產物中的 DNA 片段可以在瓊脂糖凝膠電泳中被溴化乙錠染色而檢測出來。已知濃度的對照 DNA 可以用作 PCR 產物大小和濃度的參照。
第 3 階段：用 Pfu DNA 聚合酶拋光 PCR 產物的末端
為配合某些
DNA 聚合酶而進行的引物的優化設計在 PCR 中只能很少地增加平末端片段的數目。要絕對地避免使用傳統的 Klenow
聚合酶來拋光末端，因為它還保持著相當高的外切酶活性。幸運的是，T4 和 PfuDNA 聚合酶沒有任何的 DNA 外切酶活性或 Tdt
活性，因此可以在 PCR 后用它們來產生平末端（見圖 28-4)(Hu1993;Costa and Weiner1994c，d)。
PCR
拋光是用 DNA 聚合酶除去所有 PCR 產物的 3'端核苷酸延伸。產生的拋光分子在 T4DNA
連接酶的作用下可以以很高的效率和平末端克隆載體連接。在連接前拋光 PCR 產物的末端能夠提高整個重組克隆的效率（Costa and
Weiner1994c，d;Weiner et al.1994)。
低于 50°C 時 Pfu DNA
聚合酶基本上沒有活性。這就可以讓連接反應在 4~25°C 進行，而且在 72°C Pfu
拋光步驟后直接進入連接反應。這就不需要在連接反應前抽提酶，而用 T4 DNA 聚合酶拋光時就需要在連接反應前抽提酶。只要用少量的 PCR
產物，Pfu 拋光只需 30 min 就可以產生高保真的平末端 DNA 片段。下面略述了 Pfu 拋光的大概步驟，在 PCR 后可以直接進行
Pfu 拋光或者在 PCR 產物純化后進行。
在 Pfu 拋光之前，最好先進行瓊脂糖凝膠電泳估計一下 PCR
產物的大致濃度，并確定其正確性.PCR 拋光只用 PCR 擴增反應產物的一部分，并且能夠拋光體系中所有存在的 DNA 片段。在一個典型的
25ulPCR 擴增反應中，取 5~10ul 產物進行拋光即可。
因為常規的 PCR 克隆程序需要用少董的 DNA
插入物（1~4ul），可以直接取 5~10M1PCR 產物進行末端拋光反應。如果在 PCR 后直接逬行末端拋光反應，溫度循環中剩下的 dNTP
和反應緩沖液足夠進行拋光反應（見下面）。沉淀或凝膠回收 PCR 產物也可以提高末端拋光的效率，然而如果用純化的 PCR
產物做末端拋光就需要加入反應緩沖液和 dNTP 混合物。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 儲存液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 100 mmol/L), 方法 B
2. 酶和酶緩沖液
克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)
克隆化的 Pfu 緩沖液，10X(公司提供）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 產物，純化的（方法 B) 和未純化的（方法 A)
4. 專用設備
水浴，預先調到 72°C
二、方法 A—拋光未純化的 PCR 產物
1. 拋光 PCR 制備的 DNA 片段時，把 PCR 產物直接從 PCR 反應管中轉移到一個 0.5 ml 無菌離心管，按順序加入以下試劑。
5~10ulPCR 產物
1ul 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U)
加入 ddH20 至終體積為10ul
輕輕地混勻各種成分，用熱蓋溫浴（如果沒有熱蓋，應該用礦物油覆蓋反應體系）
2.72°C 溫浴 30 min, 拋光反應。
3.30 min 溫浴后，把反應置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加到一個連接反應中。
三、方法 B—Pfu 拋光純化過的 PCR 產物
1. 拋光純化過的 PCR 產物時，移取沉淀好的 PCR 產物到一個無菌 0.5 ml 離心管，并按順序加入下列試劑。
5~10ul 沉淀 PCR 產物
1ul10X 克隆化 Pfu DNA 聚合酶緩沖液
1uldNTP 混合物（總體是 10 mmol/L，每個三磷酸核苷酸是 2.5 mmol/L)
1ul 克隆化 DNA 聚合酶（2.5U)
用 ddH20 補充到終體積為 10ul
輕輕地混勻各種成分，在熱蓋中溫浴（如果沒有用熱蓋溫浴，需要用礦物油覆蓋反應物）
2.72°C 溫浴拋光反應體系 30 min。
3.30 min 溫浴完成后，把反應體系置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加入到連接反應體系中。
PCR 產物純化(可選擇)
在進行克隆方案以前，用乙酸銨沉淀除去過剩的 PCR 引物，可以提高重組體的百分比。PCR 產物可以按下面方案鹽析出來。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙酸銨，4mol/L
乙醇，100% 和 70%
STE 緩沖液，10X(1mol/LNaCl，200 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，100 mmol/L EDTA)
TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 專用設備
真空干燥儀
二、方法
1. 加入 0.1 倍體積的 STE 緩沖液。
2. 向樣品中加入等體積的 4mol/L 乙酸銨。
3. 加入 2.5 倍體積室溫平衡過的 100% 乙醇。
4. 立即以 12000 g、10min 室溫下離心沉淀 DNA，小心倒掉上清液。
5. 加入 200ul 70%(體積分數）乙醇。
6. 以 12000 g、10min 室溫下離心，小心倒掉上清液，在其空儀中干燥沉淀。
7. 用原始體積大小的 TE 緩沖液重懸 DNA,4°C 保存。
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