• <noscript id="0aaaa"></noscript>
  • <noscript id="0aaaa"><kbd id="0aaaa"></kbd></noscript>
    <table id="0aaaa"><option id="0aaaa"></option></table>
    發布時間:2020-09-14 22:40 原文鏈接: 分析細胞學技術1

    分析細胞學是從定量的角度對細胞的各種形態學參數、生物學特征、細胞生化成分的組成及含量以及細胞的各種功能等進行研究,將以往各種細胞學技術從定性、定位進一步發展到定量的研究,獲得定量的測量數據,以更客觀地揭示生命活動的規律。分析細胞學技術的發展有兩個主要領域,固定式細胞分析和流動式細胞分析。固定式細胞分析是指細胞樣品固定在載玻片或培養皿上,通過顯微鏡,由成像系統獲取圖像,定量分析細胞的形態學參數和細胞內一些生化成分的含量。常用儀器有顯微分光光度計、圖像分析系統和激光掃描共聚焦顯微鏡。流動式細胞分析要求將細胞樣品懸浮在液體中,這些細胞懸液加入儀器后,高速度地流過儀器的檢測區,儀器檢測懸液中每一個細胞,并進行分析測定,記錄每一個細胞眾多的生物學參數,并可根據預選的條件將其中特殊的細胞亞群分選純化出來,以供進一步的深入研究,這類儀器統稱為流式細胞儀。以下對流式細胞分析技術、顯微分光光度計和圖像分析系統作簡要介紹。激光掃描共聚焦顯微鏡已在顯微鏡技術一節介紹。

    一、流式細胞分析技術
    流式細胞儀(flow cytometer,FCM )從原理上講是一種在計算機技術支持下的高度自動化的細胞顯微熒光脈沖分光光度儀,它是結合激光技術、光電測量技術、數字計算機技術和熒光細胞化學技術的產物,是分析細胞學領域的重要儀器。流式細胞術是一種對懸液中單個細胞或細胞器進行高速測量和自動分析的測量技術,每秒能測量數萬個細胞并多參數檢測,還能在分析的同時分選出有指定特征的細胞。

    (一)流式細胞儀的結構與原理
    流式細胞儀的一般結構可分為三個部分,細胞流動室和液流驅動系統;激發光源及其光束成形系統;細胞信號檢測和分析系統。這三部分在儀器中一般按三個互為垂直的軸線安置,即X軸方向的激發光軸線、Y軸方向的細胞熒光信號檢測軸線和 Z軸方向的細胞流軸線。此三個軸線的交點即為儀器的細胞信號檢測區。樣品中的每一個細胞必須按順序依次以相同的速度和軌跡通過此檢測區。每一細胞沿Z軸流經檢測區時,受到激發光照射。細胞受光照時產生細胞的散射光信號與熒光信號,這些細胞信號由檢測器收集,經計算機軟件分析處理,這就是流式細胞分析。

    流動室是流式細胞儀的核心部件,它采用液體動力學分層鞘流技術,層流技術保證樣品中的每一細胞都沿流動室的中心軸運動,實現了每一細胞以相同的速度、相同方向、相同的軌跡逐個依次通過檢測區,流動室也可稱為單細胞流發生器。激光是一種單色性、方向性、相干性好的高強度光源,是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。流式細胞儀的激發光源通常采用有多條可調諧的輸出譜線的氬離子氣體激光器,它能與多種熒光染料激發譜匹配。在實際應用時,一般采用單譜線488波長作為激發光源。檢測器采用多通道光電倍增管,由數字顯示器和示波器實時顯示各種信號波形及數據參數,結果由計算機分析處理。


    流式細胞儀分選裝置一般由超聲振動器、液滴充電電路、靜電高壓偏轉場等組成。細胞分選是在細胞分析的基礎上進行的,經確認需要分選的細胞,在該細胞到達液流斷離端的即刻,由液滴充電電路發出一個充電脈沖,保證該包含有要分選細胞的液滴斷離后帶有靜電荷。帶電液滴向下運動經過高壓偏轉電場時,在靜電力的作用下偏離原運動軌跡。帶正電荷的液滴偏向負極,帶負電荷的液滴偏向正極。靜電高壓值一般是固定的,調節充電脈沖幅度,改變液滴荷電多少,可改變充電液滴的偏轉角和偏轉距離。分選所得的細胞可以用玻片、試管、96孔板等進行收集,結合分選后的細胞培養、細胞形態學觀察、細胞圖像分析等結果,可以綜合單個細胞的更多信息,這是其他細胞學技術難以實現的。

    流式細胞儀中被測樣品的細胞,流經儀器檢測區時受到激發光的照射,激發光與細胞相互作用后可產生散射光信號和熒光信號。散射光信號是指激發光與細胞相遇作用后反射、折射、衍射等綜合的結果,它能反映細胞群體及其不同亞群形態學的一些信息,并且不依賴細胞樣品的熒光染色過程。熒光信號主要是指經過特異熒光染色后細胞受照發射的熒光信號。各種特異熒光染色方法是針對細胞內各種不同的生化成分或各種特異抗原等設計的。每一種熒光染色方法中必須用到一種或多種的熒光染料。由于每一種熒光分子結構不同,考慮熒光激發譜與熒光發射譜的接受時,通常要注意選擇合適的激發光源和各類分束濾色片。流式細胞術為了保證獲得準確的測試分析結果必須進行必要的質量控制,選用標準熒光微球和固定的雞血細胞是最常用的儀器參考標準。

    (二)流式細胞術樣品制備

    流式細胞術要做高精度的單細胞定量分析,對細胞樣品的制備技術有著特殊的要求。一般包括單細胞懸液的制備和細胞熒光染色。

    1.單細胞懸液的制備
    流式細胞術的分析檢測建立在單個細胞的基礎上,制備合格的單個分散的細胞懸液是非常關鍵的一環。對不同來源和不同形式的樣品,根據各種樣品的特點可選擇不同的分散方法。

    (1) 單層培養細胞、血液、各種脫落細胞等樣品,標本經過簡單的制備懸液,離心分離處理,就可以得到分散較好的單個細胞懸液,是理想的流式細胞術檢測對象。
    (2) 對于不同組織來源的實體組織標本,采用酶消化法、機械法和化學試劑處理法來分散細胞。
    (3) 石臘包埋組織單細胞懸液的制備,可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用,從而擴大了流式細胞術的應用范圍。樣品制備一般通過切片、脫脂、水化、消化及終止消化后過濾再收集細胞懸液,去除碎片的單細胞懸液用70%酒精固定保存。


  • <noscript id="0aaaa"></noscript>
  • <noscript id="0aaaa"><kbd id="0aaaa"></kbd></noscript>
    <table id="0aaaa"><option id="0aaaa"></option></table>
    色av