利用QTRAP研究分析細胞色素P450（CYP）反應表型

圖1.  從CYP 2B6（M3）作用得到安非他酮主要代謝產物的結構信息和碎片裂解方式。

本文研究鑒定了各種濃度下的酶代謝的安非他酮的代謝物，實驗結果證明QTRAP質譜十分適合作各類濃度的表型分析。

在評價藥物相互作用和PK值的變化時，確定生物酶對藥物的代謝作用至關重要。理想的條件下，應當知道代謝物及其相關的代謝途徑，并用來作為不同臨床相關濃度的酶動力學的定量研究。然而，在早期藥物發現過程中，因為傳統的代謝物鑒定和合成耗時又耗力，因而底物損耗被常常用作這些研究。由于靈敏度的限制，一般會在高底物濃度條件下，分離這些培養的代謝物。從如此高濃度的體外代謝研究結果看，似乎不會直接轉移到體內的情形，基于這些原因，在早期的藥物研究中限制了使用反應表型。

QTRAP是一類組合質譜技術的新機型，具備完整的三重四極桿MS/MS的質譜特點，也具備線性離子阱的功能，同時還將兩者的功能巧妙地結合起來，創造出很多特有的“串聯四極桿-線性離子阱”（以下稱“桿-阱”）的新串聯方式，在藥代分析過程中，一次進樣即可高效獲得“全部有效信息”，經常被用作底物濃度低的動力學研究，包括表型分析。

圖2.  從CYP 2C19（M5）作用得到安非他酮主要氧化代謝物的碎片信息。

安非他酮在人體內被代謝為3種主要的代謝產物，是高濃度2B6底物的1，2，3代謝物。以前的體外代謝鑒定工作是由傳統的離子阱質譜在濃度高達1mM底物的條件下完成的，這樣就人為的造成了體外數據和臨床數據的分割，因為臨床有效濃度一般在0.5~1μM。本文研究鑒定了各種濃度下的酶代謝的安非他酮的代謝物，實驗結果證明QTRAP質譜十分適合作各類濃度的表型分析。 

藥品和方法

傳統方法是通過選擇抗體或化學抑制劑，通過不同濃度的安非他酮結合人體細胞色素P450（rhCYPs）和人體肝臟線粒體（HLM）作表型分析。培養液中有磷酸鉀（50mM，pH 7.4），氯化鎂（5mM），rhCYP（pmole/ml，隨不同CYP而改變），或者人體肝臟線粒體（HLM，0.5mg/ml），和不同濃度的安非他酮。加入原型輔酶Ⅱ（NADPH，學名煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）啟動反應，加入含內標的乙腈可中止反應。按時間0，5，10，20min收集樣品。實驗在AB 4000 QTRAP LC/MS/MS完成，液相色譜為島津公司LC-20A和自動進樣器，色譜柱2X100 Luna 3μM C18，定量實驗和代謝物鑒定實驗一次完成。

圖3.  僅從HLM（人體肝臟線粒體）得到安非他酮主要代謝物的結構信息和碎裂機理。

Qtrap實驗方法

1．pMRM-EPI 實驗方法（pMRM切換至增強子離子掃描）：通過LightSight軟件自動設定和預計建立pMRM的母子離子對，這些MRM包含了所有可能產生的代謝物的母子離子，每對離子的駐留時間均為5ms，如果發現預計代謝物，儀器就自動切換到增強子離子掃描，即線性離子阱的高靈敏度子離子掃描，快速得到高質量的MS/MS譜圖。由于此實驗關注代謝物鑒定，所以各種濃度的樣品均用一種方法來分析。

2．EMS-EPI實驗方法（增強全掃描切換至增強子離子掃描）：同樣原理，在高濃度樣品條件下，可以使用LightSight軟件計算出可能代謝物，完成EMS IDA ，即高靈敏度的全掃描引導的數據相關的子離子掃描掃描。

圖4.  主要安非他酮代謝物和幾種同功酶、HLM的形成途徑。

3．MRM-EPI實驗：從pMRM-EPI實驗方法修正得MRM-EPI方法，它包括母藥及所有鑒定出的代謝物的母子離子對表，并采用較長的駐留時間，每個EPI 的駐留時間為15ms，得到最佳的譜圖。該實驗側重定量分析，但同時可以得到高質量的MS/MS譜圖。

結果和討論

QTRAP系統的分析策略

QTRAP MS具有三種獨特的“桿-阱”采集數據模式，特別適合早期藥物開發階段研究新化學實體的表型反應。

1．pMRM-EPI 方法用來鑒定可能的代謝物和作半定量分析代謝物形成過程，新的pMRM 算法可以覆蓋所有可能產生的代謝物及其碎片等信息，從而完成MRM掃描。這種采集方式的靈敏度很高，即使在底物濃度很低的情況下（0.1~1μM），也可以很好的檢測和鑒定代謝物。增強子離子掃描EPI可以提供高靈敏度的MS/MS譜圖，即使沒有合成出標準品，也可以建立相應的離子對。與此同時，pMRM半定量結果，還可以幫助確定每一個CYP的主要代謝途徑，這個也十分重要。

圖5.  M3（256/238/167在存在和不存在抗體或化學抑制劑的產生過程（1μM安非他酮）。

2．EMS-EPI實驗可用于鑒定在整個樣品反應面板上rhCYP培養的高濃度的主要代謝物，選擇高濃度底物實驗的好處是避免丟失pMRM 遺漏一些代謝物。
 
最終的定量結果可以通過串聯四極桿MRM方法或MRM-EPI完成。用MRM-EPI的最大好處就是它不僅可以提供定量結果，而且同時還可以獲得可信的MS/MS譜圖，這在研究很多種代謝物的時候非常重要，可以有效地避免相似代謝物或底物帶來的“假陽性”結果，還不需要用標準品來“甄別”這樣的假陽性。基于同時得到底物耗損和代謝物產生的數據，就可以確定每一種CYP的底物代謝機理在HLM中的分布，還計算出酶動力學參數。 

安非他酮表型結果

使用Qtrap（QqQ/LIT）新技術，共確定出８個主要的一相代謝物（M1-M8）及其相對于CYP2B6、2C19、3A4、1A2、2E1的代謝途徑，并且通過pMRM-EPI測試不同濃度下的底物濃度還鑒定了一個非-CYP 酶途徑（表1）。還有另一個代謝物M9也通過EMS-EPI分析100μM CYP3A4途徑時被鑒定，而pMRM-EPI在分析1μM 底物時也將其鑒定出來（表1）。

pMRM-EPI和EMS檢測rhCYP培養出的安非他酮代謝物

CYP2B6是對T-丁基羥基安非他酮代謝物（M3，256/238/167，圖1）產生主要作用的同工酶。而芳香環氧化代謝物（M1，4，5和6，圖2）是主要由CYP2C19作用產生的，特別是在底物濃度低的情況下（< 10μM）。

還原代謝物（M8，242/186/168，圖3）主要在HLM中形成，呈現出與非-CYP 有關。簡而言之，代謝物的結構信息和相關的同工酶共同作用的代謝途徑，從rhCYP培養的代謝物鑒定的結果來看就很清楚（圖4）。

圖6.  M1，4, 5，6（256/200/182）在存在和不存在抗體或化學抑制劑的產生過程（1μM安非他酮）。

從MRM-EPI方法分析HLM 培養液同工酶抑制劑的結果也可以清晰地看到2B6 與產生M3代謝物有關（圖5 ），而 2C19 則與產生 M1，M4，M5 和M6有關（圖6）。用MRM-EPI分析用抑制劑在HLM培養的定量結果和單獨用三重四極桿MRM的定量結果是一致的（圖7）。

圖7.  比較MRM和MRM-EPI定量結果（1μM 安非他酮）。

綜上所述，CYP 2C19，CYP2B6 和CYP3A4，和安非他酮的幾種羥基化代謝途徑有關，其中CYP2B6 (酶的高 Km值)，CYP2C19 只有在安非他酮在低底物濃度時產生代謝，其他涉及到 CYP2B6，CYP2C19，CYP3A4在安非他酮次要代謝途徑被鑒定出來，而相關的分布也被預測。

結論

QTRAP儀器的MRM-EPI可高靈敏度和有效地分析早期表型反應，這是串聯四極桿-線性離子阱有機結合在一起的范例。

pMRM-EPI是一種高靈敏度、高智能化地檢測低濃度代謝物的手段，特別適合研究酶動力學。

結合QQQ/LIT的各種掃描方式，可以同時獲得定量和定性結果。 

LightSight 2.0軟件高效定量和定性分析藥物代謝物。

本實驗方法特別適合早期表型研究，特別是樣本量大的研究，有效避免錯誤的信息引起的重大損失。