制滴菌素A對小鼠克隆胚胎的染色體重建

實驗概要

體細胞移植胚胎制備完成后，若用制滴菌素A(TSA)處理一下，其胚胎制備效率會顯著增加。本次試驗中以小鼠早期SCNT胚胎為研究對象，檢測了TSA在體細胞核重編程方面的影響；檢測方面包括：染色體重排、組蛋白修飾、DNA復制和轉錄活性恢復。

實驗步驟

1. 卵母細胞收集

B6D2F1雌鼠注射5 IU馬絨毛膜促性腺激素，48h后注射5IU人絨毛膜促性腺激素(hCG)。注射hCG 16h后從小鼠輸卵管收集卵母細胞。收集到卵母細胞后，在HEPES-CZB中用0.1% hya 脫顆粒細胞獲得裸卵。挑選細胞質均勻的卵母細胞轉移入含1%BSA的KSOM液中，然后放入37°C培養箱中待用。

2. 精子注射用于核移植

利用胞質內精子注射技術(ICSI)制備受精胚胎。用piezo活化顯微操作系統對準精子“頸部”反復吹打，將精子頭部與尾部分開。室溫條件下，將精子頭部注入卵母細胞內。使重構胚恢復10-20min，然后將其移入KSOM液中，在37°C培養箱中培養待用。

3. 制備卵丘細胞為供體細胞的核移植胚胎(NT)

制備好的胚胎在含50nM TSA的激活液中培養6h以抑制HDAC。后將胚胎轉入含50nM TSA的KSOM中培養4h。最后將培養移入純培養液中培養。

4. DNA合成的檢測

通過摻入的5-BrdU(脫氧尿苷)檢測DNA的合成。胚胎在10μM BrdU中孵育30min。胚胎用4%多聚甲醛中固定，然后利用間接免疫熒光顯微鏡檢查觀察DNA中摻入的BrdU量。

5. 在胚胎中摻入BrUTP并檢測新的轉錄物

胚胎在電透化液(含0.25M葡萄糖，100 μM CaCl₂.2H₂O，100 μM MgSO₄ and 0.1% PVP)中洗兩次，然后移入轉錄液(電透化液 10mM BrUTP,BrUTP：5-溴尿核苷 5’-三磷酸根)中。然后將胚胎轉入覆蓋有20μL轉錄液的電促細胞融合儀的兩電極中間；采用250V/cm，80 μs，2次的參數，對胚胎進行透化，(每次透化間隔為2min)。胚胎透化后2min移入CZB中培養1h然后再移入上述轉錄液中。最后胚胎用4%多聚甲醛中固定，用間接免疫熒光觀察轉錄物種摻入的BrUTP的含量。在陰性對照組的EP液、轉錄液、KSOM液中加入5 μg/mL 鵝膏菌素(RNA聚合酶 II和III的抑制劑)。

6. 免疫熒光顯微鏡檢查

本次試驗中使用的抗體是兔抗組蛋白H3 絲氨酸10磷酸的多克隆抗體(1:100稀釋)，兔抗組蛋白H3絲氨酸28磷酸的多克隆抗體(1:100稀釋)，兔抗組蛋白H3賴氨酸4乙酰基多克隆抗體(1:100稀釋)，兔抗組蛋白H3賴氨酸4二甲基多克隆抗體(1:100稀釋)和鼠抗BrdU單克隆抗體(6μg/mL)。用鼠抗Lamin B單克隆抗體標記細胞膜。二抗為Alexa-Fluor-568 標記的山羊抗鼠 IgG抗體或Alexa-Fluor-488 標記的雞抗兔 IgG抗體(1:200稀釋)。用2 μg/mL4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Molecular Probes)標記DNA。

為了檢測DNA合成，在胚胎進行一抗孵育前，固定后的胚胎用2N HCL室溫處理1h，后用100mM Tris/HCL(pH 8.0)中和20min，之后用含1%BSA的磷酸鹽緩沖液洗凈。然后再按照上述步驟進行免疫熒光的檢測等。

7. 細胞核中熒光強度的定量檢測

對胚胎進行Confocal檢測，細胞核中的熒光強度用相關軟件進行定量分析。核中熒光強度通過手動描繪顯示器上細胞核的輪廓來計算。細胞核隨機選擇，每枚細胞核的熒光強度通過五個不同區域計算后平均所得，并且細胞質的熒光強度影響已經被減去了。用計算出的熒光強度與核體積相乘得出相對值進而計算核總熒光強度。為了計算核體積的變化，任意的將SCNT胚胎用TSA處理過后6h是的核體積定義為100%。每個試驗組在不同時間的核體積根據此時間的核體積進行相對值計算。為了定量化BrUTP，將每次試驗中受精胚胎中BrUTP的最大值定義為100%，其他試驗組的熒光強度根據此強度進行相對計算。我們根據熒光強度將新生成的RNA分為三個層次，高(>60%)中(20–60%)低(<20%)。