前沿顯微成像技術專題——超分辨顯微成像（1）

從16世紀末開始，科學家們就一直使用光學顯微鏡探索復雜的微觀生物世界。然而，傳統的光學顯微由于光學衍射極限的限制，橫向分辨率止步于 200 nm左右，軸向分辨率止步于500 nm，無法對更小的生物分子和結構進行觀察。突破光學衍射極限，一直是科學家們夢想和追求的目標。

雖然隨著掃描電鏡、掃描隧道顯微鏡及原子力顯微鏡等技術的出現，實現納米級的分辨率已經成為可能，但是以上這些技術存在對樣品破壞性較大，只能觀測表面等缺點，并不適合生物樣品，特別是活體樣品的觀測。近十幾年來，一系列適合生物樣品成像的超分辨成像技術應運而生，包括結構光照明（SIM），受激發射損耗熒光顯微技術（STED），光激活定位顯微技術（PALM），隨機光學重建顯微技術（STORM）等等。

光學分辨率極限

光以波的形式傳播，當一個點光源通過透鏡在成像面聚焦為一個小光點時，不管物鏡有多好，成像光點都會比實際的發光點大。這是因為光波在物鏡光闌的邊緣會發生衍射，將波前向外擴散（圖1）。

圖1 發射熒光在物鏡孔徑邊緣發生衍射

衍射光斑有一個明亮的中心點，以及環繞它的一系列亮度漸弱的衍射環，稱為艾里斑。當兩個點過于靠近，所成的像斑重疊在一起，就分辨不出是兩個點的像了。因此，光學分辨率存在一個極限。根據瑞利判據，當一個艾里斑的中心與另一個艾里斑的第一級暗環重合時，剛好能分辨出是兩個點所成的像（圖2）。用公式表示如下：

d = 1.22λ / 2NA

d表示分辨率，λ是發射光的波長，NA是物鏡數值孔徑。

圖2 光學分辨率極限示意

以GFP為例，λ=510nm，采用NA=1.4的物鏡，光學分辨率的極限就是222nm。但是在生物系統中，膜蛋白，轉運蛋白和核糖體等亞細胞結構往往小于50 nm，而且通常不會間隔足夠遠。這樣一來，就不可能直接對其進行清晰的成像。

怎么辦呢？科學研究的腳步當然不可能止步于此。為了克服衍射極限，研究人員開發了一系列超分辨成像方法。在本期中，我們將首先為大家介紹單分子定位超分辨顯微成像技術~

這種超分辨顯微技術都是通過選擇性地打開和關閉單個熒光基團，確保成像區每次僅有少量、隨機、離散的單個熒光分子發光，再通過高斯擬合，定位單個熒光分子(點擴散函數)的中心位置（圖3），以實現高精度的空間定位，最后將系列圖片疊加合成一幅超分辨圖像。

圖3 通過高斯擬合進行定位

不同的技術所使用的“開關”熒光的方法不同，下面我們就來看看它們各自的原理和特點吧~

光激活定位顯微技術（PALM）

PALM (Photoactivated Localization Microscopy)由Eric Betzig和Harald Hess于2006年首次發表于《Science》。它的原理其實非常簡單，一句話概括就是通過“開關”與目標分子結合的光激活熒光蛋白，對其進行分批定位，確定中心光斑的位置。

光激活熒光蛋白PA-GFP是綠色熒光蛋白的變種，可以被適當波長（405nm）的激發光激活。實驗時首先隨機激活一部分熒光蛋白，再用488nm激發熒光，就可以只采集一部分目標分子的熒光信號。熒光蛋白被激活的概率與激發光的強度成正比，只要激活的蛋白足夠少，相距足夠遠，就可以對其進行定位。完成數據采集后，對這些熒光蛋白進行光漂白直至完全失活，然后再激活另一些熒光蛋白進行定位。重復這個過程，就可以將樣品中的所有目標分子定位，將這些原始數據合并，就能得到目標分子的超分辨圖像。

Betzig等人在文章中將PALM與全內反射熒光顯微鏡（TIRF）進行了比較（圖4）。可以看到PALM對于熒光分子的定位精度遠高于TIRF。

圖4 TIRF（A）和PALM（B）對溶酶體膜的成像效果比較（Betzig et al., 2006）

隨機光學重建顯微技術（STORM）

STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 由華人科學家莊小威等人同樣于2006年發表于《Science》雜志。它的基本原理與PALM類似，不同的是STORM使用合成的光轉換熒光染料，而不是光激活熒光蛋白與目標分子結合。那么它是如何控制熒光的開關的呢？

熒光染料被激發進入發射態，之后會進入暗態（Dark state），在暗態中它們將與自由氧結合，進入漂白狀態。在漂白狀態下，染料不會再次發出熒光。如果不讓染料與自由氧結合，它將無法進入漂白狀態，一直維持在暗態。高功率的激發光可以使染料從暗態再次進入發射態。這種從亮到暗再到亮的狀態切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。

和PALM一樣，STORM也是通過隨機的分批“點亮”目標分子來進行超分辨定位（圖5）。由于消除了光漂白步驟，STORM可以更快地采集數據。不過，STORM高度依賴于熒光染料的特性：既需要產生足夠強的信號，同時又要有良好的閃爍密度。如果染料閃爍得太快，相鄰的分子之間可能會有很多干擾，無法定位單個分子；但是如果它們閃爍得太慢，可能無法獲得足夠的圖像來定位每個分子。STORM最初使用的染料是cy3和cy5，不過目前最流行的是Alexafluor 647。

圖5 哺乳動物細胞微管和CCP的雙色STORM成像（Bates et al., 2007）

DNA-PAINT

DNA-PAINT (DNA-Based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) 是一種比PALM和STORM更新的技術，由Ralf Jungmann等人于2014年發表。它的原理是利用DNA鏈的互補性產生類似于熒光分子閃爍的效果。

在DNA-PAINT中，雙螺旋DNA鏈的其中一條與目標分子相連，作為“對接”鏈，另一條被熒光標記，作為“成像”鏈。由于DNA鏈彼此之間是高度特異性結合的，因此成像鏈和對接鏈在溶液中會自發結合，在焦平面上產生單分子熒光。通過調整成像鏈的結合強度和濃度，可以反復產生瞬時結合，獲得類似STORM中熒光染料的最佳閃爍速率。對獲得的數據進行重建，就可以得到最終的超分辨率圖像（圖6）。

除了可調控的結合速率外，DNA-PAINT的另一個顯著優點是任何熒光染料都可以用于成像 鏈，便于進行多色成像。

圖6 DNA-PAINT獲得的Hela細胞微管 (綠色) 和線粒體 (洋紅色) 的雙色超分辨率圖像（e）和相同區域的衍射極限圖像（f）效果對比（Jungmann et.al., 2014）

PALM，STORM等單分子定位超分辨顯微成像技術自誕生以來，被廣泛的應用到了各種研究領域，極大地增強了定位亞細胞結構與探索它們之間相互關系的能力。譬如對局部粘著復合物及其分布進行納米尺度的成像，細胞骨架中細微結構的成像等。

那么，超分辨顯微定位的分辨率是由什么決定的？獲得的大量圖像數據如何進行重構？……請聽下回分解。

References

Bates, W. M., Huang, B., Dempsey, G. T., and Zhuang, X. (2007) Multicolor Super-resolution Imaging with Photoswitchable Fluorescent Probes. Science. 317(5845): 1749–1753. doi: 10.1126/science.1146598

Betzig, E., Patterson, G.H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., LippincottSchwartz, J., Hess, H.F. (2006) Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313(5793): 1642-5; DOI: 10.1126/science.1127344

Jungmann, R., Avenda?o, M. S., Woehrstein, J. B., Dai, M., Shih, W. M. & Yin, P. (2014) Multiplexed 3D cellular superresolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. Mar; 11(3): 313–318. doi: 10.1038/nmeth.2835

Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. (2006) Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. Oct;3(10):793-5. DOI: 10.1038/nmeth929

Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F. & Jungmann, R. (2017) Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. Jun;12(6):1198-1228. doi: 10.1038/nprot.2017.024