試劑、試劑盒 包涵體沉淀緩沖液 A脫氧膽酸鈉N-十二烷基肌氨酸鈉
儀器、耗材 Tissuc-TearorTM 勻漿器透析袋POROS 50S 陽離子交換柱SDS-PAGE 電泳裝置
實驗步驟
材料與設備
包涵體沉淀 (見實驗 1,P.147)
Tissuc-TearorTM 勻漿器（FisherScientific15-338-55)
透析袋 (Spectra/PorTM6; 截留分子量 25000Da)
POROS 50S 陽離子交換柱（PerSeptive Biosystems)
SDS-PAGE 電泳裝置
試劑
緩沖液 A
緩沖液 A+1mol/L NaCl
緩沖液 A+50% 甘油
脫氧膽酸鈉（DOC)(20% 儲液)
N-十二烷基肌氨酸鈉（SKL)(20% 儲液)
(配方，見“試劑的配制”，PP.184~189)
操作程序
用 N-二烷基肌氨酸鈉溶解包涵體沉淀
1) 加 18 ml 緩沖液 A 和 2 ml 20%DOC 儲液于包涵體沉淀（DOC 凈濃度為 2%）。用組織破碎器（Tissue-Tearor）充分重懸沉淀, 室溫下靜置至少 10 min。
注：洗滌前，包涵體沉淀中的白色圓形部分是包涵體蛋白。其上的褐色層為各種細胞碎片。2%DOC
能相當有效地溶解這些碎片。在低溫和沒有蛋白質存在的情況下，pH 低于 8.0 時，2%DOC
會形成水凝膠（hydrogel)。如想獲得凝膠，提高 PH 和溫度即可。
2) 懸液于 4°C、13000r/min 離心 10 min。上清棄去前，取上清留樣（樣品 C)。為確保沉淀得到充分洗滌，再次按步驟 1 所述操作重懸沉淀。將懸液分成兩個相等的部分（#1 管和#2 管)，于 4°C、13000r/min 離心 10 min(不需要對上清取第 2 次樣)。
方案補充實驗：在第 2 次 13000r/min 離心前，取 6X50ul 懸液分別轉至 Eppendorf 管，用以確定溶解包涵體沉淀所需的 SKL 量（見 p.173)。
注：第 2 次洗滌包涵體是為了去除第 1 次離心時殘留在沉淀物屮的細胞碎片。沉淀呈橘黃色是由于培養細胞時用了利福平。如不用利福平，則沉淀應近似為白色。如沉淀帶褐色或深乳酪色，這很可能是由于戲留了一些未破碎的細胞。
3) 對#1 管中的沉淀，加 19.7 ml 的緩沖液 A 和 0.3 ml 的 20%SKL 儲液 (SKL 凈濃度為 0.3%)。應劇烈攪動使沉淀慢慢溶解。然后至少靜置 30 min。
注：1.
至此，不溶性蛋白質大多是變性的，故不必擔心劇烈攪拌；2. SKL
是一種溫和的陰離子去垢劑，可溶解許多包涵體蛋白，當用透析或層析將它從蛋白質中去除時，即可使蛋白質復性。SKL 可與蛋白質結合，故必須加入足夠量的
SKL 以滴定蛋白質——看來，至少需要 1 mg SKL/mg 蛋白。當蛋白濃度較高時，可能要求 SKL
的濃度商于臨界膠束濃度（CMC;~0.4%)。
方案補充實驗：2 管中的沉淀將用于試驗蛋白質溶解和重折疊的其他方法（見 PP,179~181)。
4)#1 管中溶解的蛋白質懸液，于 4°C、13000r/min 離心 10 min。收集上清（取樣品 D), 棄沉淀（沉淀不應太多）。
透析除去去污劑使可溶性蛋白重折疊
1) 對溶解的物料進行蛋白定量測定〔制作標準曲線時，必須用含 0.3% SKL 的牛血清白蛋白（BSA)〕。用緩沖液 A+0.3%SKL 稀釋，將溶解蛋白的濃度調至 1 mg/ml。
2) 用緩沖液 A 將溶解蛋白制備液稀釋 10 倍，使蛋白終濃度約為 0.1 mg/ml,SKL 終濃度約為 0.03%。
3)4°C 下，溶解蛋白制備物（體積約 200 ml) 對 2000 ml 緩沖液 A 透析 8 小時，同時充分攪拌。然后換新鮮緩沖液并重復。
方案補充實驗：每 4 h, 取 150-ul 樣品，用反相高效液相層析 (HPLC) 測定去垢劑含量。這樣可以確定透析去除 SKL 需要多長時間和加到離子交換柱的樣品中有多少去垢劑存在（見 P.176)。
注：透析含 SKL(或許多其它去垢劑的溶液時，可遺成一緩慢的去除去垢劑的梯度，這一步非常有用，可使蛋白質有時間歷經種種構象狀態，從而進行正確的折疊，同時避免不希望有的疏水聚集作用。看來，如透析去除所有的 SKL,σ32 及其他一些蛋白質將會發生聚集。因此，這里推薦的透析操作不宜完全去除 SKL, 只要慢慢降至 0.01%~0.02% 即可，剩余的去垢劑可在下一步除去，屆時，σ32 結合于離子交換柱，經洗柱后再用鹽溶液進行梯度洗脫。
離子交換層析
1) 從透析袋中移出經透析的蛋白質溶液，4°C、8000r/min 離心 20 min, 除去所有聚集物。
2) 留上清 (取樣品 J), 加載于 POROS 50S 陽離子交換柱，作最后一級的分級分離。
注：pH7.9 時，σ32 荷負電為-46 與+40 之和；σ32 的滴定曲線，見本書“緒論”部分，圖 0-2.p.3)。因凈電荷為-6, 故σ32 可與 POKOS 50Q 陰離子交換柱上荷正電的季銨基團
結合。也可用其它陰離子交換柱，如 Q Sepharose Fast Flow、Mono Q 等。預期，所有殘留的 SKL 將結合于 POROS 50Q。由于有大量荷正電的殘基，故也能與陽離子交換柱結合。因此，也可以用荷負電的離子交換柱如 POROS 50S,S-Sepharose Fast Flow 或 Mono S 來純化σ32。但對σ32 的純化，陽離子交換柱優于陰離子交換柱，因為殘留的和從結合蛋白解離下來的 SKL 將穿柱而過，并不會結合于柱上。實際上，甚至有可能完全免除透析操作. 直接將稀釋的蛋白質樣品加載于 POROS 50S 柱即可。
3) 用緩沖液 A 洗滌層析用的介質，然后將其傾入帶適配器接頭的玻璃柱中，裝成一總體積為 5 ml 的層析柱。用緩沖液 A+1 mol/L NaCl 洗柱，并用緩沖液 A 平衡柱子。
4) 如透析是在低鹽條件下進行的（如本實驗中)，則可在室溫下以 4 ml/min 的流速直接將蛋白質樣品加載于層析柱上。
5) 用緩沖液 A 洗柱 15 min。然后在 60 min 內，以 4 ml/min 的流速，進行梯度洗脫 (0~lmol/L NaCl/緩沖液 A)。檢測 260nm 和 280nm 處的吸收，分部收集 4-ml 組分。
6)SDS-PAGE 電泳分析（見附錄 5) 各組分，并合并峰組分供進一步分析。合并的峰組分可通過對緩沖液 A+50% 甘油透析、制備后，儲存（如下文所述）。圖 3-2 為典型的 SDS 凝膠電泳照片，示例說明了本實驗所得的結果。
提純的蛋白質的儲存
1)4°C 下，將合并的峰組分對替換的緩沖液 A+50% 甘油透析過夜。
2) 測量 A280nm，并按實驗 5 所述方法.（PP.167~169) 測定消光系數，計算蛋白濃度
3) 短期（數天至數周）可儲存于-20°C; 在此溫度下，因有 50% 甘油存在，故樣品不會凍結。長期應凍存于-70°C。
注：這種儲存方法有若干優點。首先，由于透析袋中水分子透出的速度比甘油進入的速度快，故可使樣品濃縮約 3 倍。其次，在此條件下，大多數酶干-70°C 可穩定存放數年，本法的一個缺點是，有一些酶在進行酶學或蛋白質化學研究前，必須除去甘油。如蛋白質濃度足夠高，則可稀釋之，直至甘油的影響可忽略不計。否則，樣品需通過透析以除去其中的甘油。另一個缺點是試劑級純的甘油成本較高（~31 美元/升）。節省甘油的一個竅門是，先在高的帶刻度的量筒中進行透析，不要攪拌。透析袋內的水很快從袋內透出這就是濃縮 3 倍的原因且因水的密度低于 50% 甘油儲存緩沖液，故會浮在量筒的上層。小心地傾出緩沖液上層的 10%~20%, 以去除大部分的水，然后使量筒中的緩沖液混勻達到平衡。這樣可有效地替換緩沖液而不必用更多的甘油。