包涵體蛋白溶解后的重折疊實驗

實驗步驟

一、常規操作方案

下面這個典型流程對許多蛋白質都有很好的效果。本 操 作 方 案 是 根 據 N g u y e n 等(1993)首先開發的方案改編而成，并用于冷泉港蛋白質純化與鑒定課程的不溶性重組蛋白純化部分（Burgess and K n u t h ， 1996)。其他類似的流程也可能給出相似的結果，但我們實驗室幾乎只使用該流程。下面我們將會對關鍵步驟進行討論。

(1) 使 用 含 有 I L L B 培養基的2 L 培養瓶, 在 37°C 、振搖條件下培養攜帶了 p E T 載體 (克隆有目標基因）的 大 腸 桿 菌 B L 21(D E 3)p L y S 菌 株（Studieretal.， 1”0), 直 A_600nm達 到 0.6。

(2) 加人異丙基-β-D-硫化半乳糖苷(I P T G ) 至 0. 5? I m m o l /L ，誘 導 T 7 R N A 聚合酶的表達，然后該酶進行目標基因的轉錄。

(3) 誘 導 3?4 h 后 ，15 000 r/min 離 心 15 min以收獲細胞，用小體積的培養上清液重懸細胞，然后將其轉移至預先稱重的40 mL橡樹嶺(Oak Ridge)離心管中, 離心以沉淀細胞。記錄細胞沉淀的濕重，并凍存于一80°C 待用 。用 此 方 法 一 般 每 升 可 得 到 1.5?2.0 g濕重的大腸桿菌細胞。

(4) 解凍細胞，用 30 m L 裂解緩沖液[50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7. 9)，0.1 mmol/ LEDTA,5% 甘油，0.1mmol/L DTT,0.1mol/L NaCl]重懸，然 后 用 60% 的 功 率 超 聲 3次或 4 次 ，每 次 20 s ，每次間隔 I m i n 于冰上冷卻。

(5) 加入純的 Triton X -100(來 自 1 0 % 的質量體積濃度的儲存液)至 1 % 以分解細胞膜和溶解膜蛋白。將裂解物于冰上孵育10 m i n ，然 后 15 000 r A n i n 離 心 15 m i n 以沉淀包涵體 ，最后移走可溶性上清液。

(6) 用 30 m L 含 1 % Triton X -100的裂解緩沖液重懸包涵體，冰上孵育10 m i n ，然后15 000 r /m i n 離心 15 m i n 。

(7) 將去除了上清液的包涵體沉淀用30 m L 不 含 Trinton X -100的裂解緩沖液重懸以去除 Trinton X -100, 然后同上條件離心。得到的沉淀稱為洗滌后的包涵體成分，其純度通常高于9 0 % 。

(8) 將洗滌后的包涵體沉淀重懸于合適的變性劑，并 孵 育 使 之 變 性 和 溶 解 ，然后15 000 r/m i n 離 心 15 m i n 以除去任何殘余的不溶物。我們通常使用上述裂解緩沖液 (如果 用 鹽 酸 胍 稀 釋 則 不 含 N a C l ) ，同 時 加 人 6 m o l/L 鹽 酸 胍（guanidine hydrochloride，G u H C D ，8 m o l/L 尿素（urea)或 0 . 3 % 十 二 烷 基 肌 氨 酸 鈉 [或 稱 為 N -月桂酰肌氨酸鈉(sarkosyl 或 n-lauroyl sarcosinate)]以使包涵體溶解。

(9) 最近，我們采用了一種相對簡單的重折疊實驗(見下文）以鑒定出合適的重折疊緩沖液。

(10) 將變性樣品中的蛋白質濃度調整至I m g /m L 。

(11) 將變性蛋白質稀釋15?6 0 倍, 以使變性劑濃度降低至蛋白質可以進行重折疊的程度。通常我們或是快速地稀釋，或是緩慢地將變性的包涵體蛋白滴加至燒杯中的重折疊緩沖液中，同時劇烈攪拌以快速混勻。稀釋過程在室溫下進行，混勻完成后, 將溶液靜 置 1?2 h 以保證重折疊過程的完成，同時也使聚集物形成并出現絮凝物。

(12) 用蛋白質低親和的 0. 22um 濾膜(如 Stericup——GV 0. 22 m m o l /L ， 500 m L ，Millipore # S C G V U 05R E )過濾重折疊的蛋白質溶液以去除顆粒狀物質（如果有明顯的沉 淀 ，其可能會堵塞濾膜，可在過濾之前進行離心)。

(13) 將過濾后的溶液盡可能快地(要在柱子和系統壓力限制容許的范圍內，希望至少 10 mL/min)栗 入 10? 15 m L 的 離 子 交 換 層 析柱 。如 果 條 件 允 許 ，監 測 280 nm、260 nm和 320 m n 處的吸光度。其 中 320 n m 處的光吸收用于測量光的散射, 對于某些蛋白質來說，它可顯示多聚體形成的峰。

(14) 用 5?1 0 個柱體積的添加了 〇? I m o l / L N a C l 的 緩 沖 液 A [50 m m o l / L Tris-HCL(pH 7 . 9 ) ，5 % 甘 油 ，〇 . 1 mol/L EDTA, 0.1mmol/L DTT] 沖 洗 柱 子 ，然 后 用 1 0 個柱體積的在相同緩沖液中的0. 1?1. 0 m o l / L N a C l 的線性梯度洗脫，流 速 為 5 m L /m i n ，每 份 收 集 3?4： m L 。

(15) 用 S Ds- P A G E 分 析 280 n m 的吸收峰, 確定不同收集組分的純度。如果能夠進行酶活性分析，那么分析各收集組分以確定具有最髙特異性活性的組分。

(16) 混合各收集峰，用 含 5 0 % 甘油的裂解緩沖液透析，然后凍存于一20°C 或一80°C 。

(17) 鑒定混合的收集峰。如果可能, 將其特異性活性與該蛋白質標準樣品的活性進行比較，該標準品的制備使用的是不涉及重折疊的更常規的方法。

二、對該常規操作流程的評論

1. 大腸桿菌中重組蛋白的過表達

獲得高水平表達與重折疊是不同的主題，在此不會進一步討論(可見本部分的第12章 )。許多系統可以獲得占總細胞蛋白質1 0 % ?4 0 % 的目標蛋白質表達水平(Mak r i d e s，1996; M u r b y et al.， 1996; Sorensen and M o r t e n s e n， 2005; Studier et al,， 1990)(見本章 第 9 節）。通常 ，研究者需要做實驗以確定在什么溫度下培養細胞、使用多少誘導劑以及誘導多長時間。當目標蛋白質實現髙水平的誘導表達后, 通常會將細胞離心，然后凍存于一80°C 待用。有些說法認為，將細胞凍存數周會使得包涵體難以重折疊，但據我的經驗 ，我們可以使用凍存了數月的細胞做出很好的重折疊效果。然而遺憾的是, 據我所知，
尚無系統的研究探討這一問題。

2. 包涵體的洗滌

我 們 最 初 用 2 % 的 去 氧 膽 酸 鈉（sodium deoxycholate)洗 滌 包 涵 體（Burgess andKrmth， 1996; N g u y e n e t a l ., 1993) ，但后來發現1% 的 Triton X-100效果更好、使用更方便 。強 烈 推薦大家使用我稱為「美食家」（g o u r m e t) 的 Triton X-100[Pierce,Surfact A m p s X -100, 1 0 % (m /V )溶液], 其經過純化除去有時會在舊的淡黃色瓶子里保存的T r i t o n X -I O O 中發現的過氧化物后，保存在密封于安瓶瓶(am p o u l e) 的氮氣中。可以嘗試用不同的鹽和去污劑作用以觀察哪一種能夠更有效地洗出包涵體中的雜質，而同時又不會溶解目標蛋白質，有時候也可以用1?2 m d /L 的尿素洗滌。一般來說，在溶解包涵體之前，需要洗掉盡可能多的膜成分、D N A 及其他蛋白質。

3. 包涵體的溶解

如之前所說，有 些 包 涵 體 蛋 白 接 近 天 然 狀 態 ，用 溫 和 的 條 件 ，如 非 離 子 去 污 劑(nonionic detergent)或者甚至 0?5 m o l / L N a C l 就可以將其溶解（V e r a et al.， 2006)。大多數情況下，這種做法是不行的，而是需要使用更強烈的變性條件。

與前面的裂解緩沖液一樣，促溶劑/變性劑（solubilizing agent/denaturant) —般溶于緩沖液中，以控制 p H 、螯合重金屬以及維持還原的環境。通常 ，用促溶劑重懸包涵體, 孵育 30?60 min，然后離心除去不溶的物質。由于包涵體中的蛋 白 質 至少是部分變性的，所以溶解可在室溫下操作，有時甚至需要給溶液加熱以實現完全溶解。例如，當把天然的
綠色突光蛋白（green fluorescent protein，GFP)溶 于 6 m ol/L 鹽 酸 胍 時 ，在室溫下其仍然具有熒光，但 在 75°C條 件 下 ，其 會 在 I mi r i以 內 變 性 并 失 去 熒 光（R. Burgess和 N.T h o m p s o n ，未 發 表 的 結 果）。 對 促 溶 作 用 更 詳 細 的 論 述 可 參 考 Marston和 Hartley(1990) 的文獻。

下面是對幾種促溶劑使用上的評論。

(1)鹽 酸 胍 它 可 能 是 最 常 用 的 促 溶 劑 ，通常 其 在 相 容 緩 沖 液 中 的 使 用 濃 度 為6 m o l /L 。在這種強的離液劑中 (chaotropicagent)，大部分蛋白質會迅速變性，但許多時候在較高溫度下孵育會有助于實現蛋白質完全變性。一旦溶解后，稀 釋 至 3 m o l /L 鹽酸胍通常也沒有問題, 因為從變性狀態到天然狀態的變化通常發生于1?2 m o l /L 鹽酸胍的水平 (P a c e, 1986)。通常稀釋至約0.1 m 〇l/L 鹽酸胍就可以實現足夠低的鹽水平，以保證重折疊的目標蛋白質結合于離子交換層析柱 (見下文)。

(2) 尿 素 8 m o l / L 尿素是常用的促溶劑，尤其用于在變性狀態下進一步純化目標蛋白質( K r m t h and Burgess, 1987)。 一 般 8 m o l / L 尿素在促進蛋白質溶解和使蛋白質完全變性方面不如 6 m o l / L 鹽酸胍那么有效。必須注意到總是存在于尿素溶液中的氰酸鹽(cyanate) 可能引起蛋白質的氨甲酰化(carbamylation)(本 書 第 4 4 章對如何盡量降低尿素中的氰酸鹽提出了建議)。

(3) 十二烷基肌氨酸鈉或十二烷基磺酸鈉（sarkosyl或 S D S ) 研究者發現, 十二烷基 肌 氨 酸 鈉 作 為 有 效 的 促 溶 劑 ，能 夠 幫 助 蛋 白 質 在 更 高 的 濃 度 下 重 折 疊（Burgess，1996)。十二烷基肌氨酸鈉是一種很強的陰離子變性劑, 很像S D S ，但其與蛋白質結合得更 弱 ，比 S D S 更易解離。通常包涵體可以溶解于0. 3% 的十二焼基肌氨酸鈉, 但必須注意的是不能用十二烷基肌氨酸鈉溶解等于或超過自身重量的蛋白質。例 如 , 如果你要溶解含 有 150 m g 目標蛋白質的洗滌過的包涵體, 用20 m L 0. 3 % 的十二烷基肌氨酸鈉(60 m g十二烷基肌氨酸鈉)不能溶解完全。你必須加人至少50 m L 0?3 % 的或者30 m L 0. 5 % 的十二烷基肌氨酸鈉。

我們注意到, 如果在包涵體中存在許多Triton X -100，那么需要更多的十二烷基肌氨酸鈉來溶解目標蛋白質。幾乎可以確定，其 原 因 是 Triton X -100可以形成大的微團, 并且可以吸收一些十二烷基肌氨酸鈉形成混合微團，而微團是沒有促溶解作用的。

如 果 將 0. 3% 的十二燒基肌氨酸鈉溶解的目標蛋白質稀釋至約0?01 % 的十二焼基肌氨酸鈉, 大部分十二烷基肌氨酸鈉就會從蛋白質上解離下來, 蛋白質就會重折疊。殘余的去污劑似乎是與部分重折疊的蛋白質的疏水區(黏性位點)結合，從而阻止聚集作用。其就 如 同 化 學 伴 侶（chemical chaperone)— 般 發 揮 作 用 。如 果 你 的 目 標 蛋 白 質 能 夠 和P O R O S H S 之類的陽離子交換柱(cation-exchange c o l u m n)結合, 那么稀釋后的溶液可以經過過濾，然后泵人1〇 m L 的柱子，用 10?2 0 個柱體 積 的 0.1 m o l /L 的 N a C l 緩沖液沖洗 ，然后用鹽濃度梯度洗脫(見 本 章 5. 5 節），目標蛋白質將會結合在柱上，而游離的十二焼基肌氨酸鈉則會流穿，結合在蛋白質上的殘余的十二烷基肌氨酸鈉也會在長時間沖洗中解離。對洗脫蛋白質的實驗分析表明，蛋白質中基本上沒有(10個蛋白質分子中少于1個十二院基肌氨酸鈉分子)殘余的十二烷基肌氨酸鈉（R . B u rgess, 未發表數據）。不要
用 M o n o S 柱做此工作，因為十二烷基肌氨酸鈉會同該柱子結合，并損壞柱子，而且會污染你的洗脫蛋白質。

SDS也可以以類似的方式使用，但必須注意的是，使 用 的 SDS不能含有長的鏈烷烴(alkane)，如 C14、C1 6 等 。用 在 S D S 中 變 性 的 G E P進 行 的 重 折 疊 實 驗 效 果 很 好（R.Burgess、N. Thompson和 R. Chumanov, 未發表數據），因此應該考慮使用SDS作為有效的促溶劑。

已有相關文獻報道利用陽離子變性劑氯化十六烷基三甲基銨(cetyltrimethylammo-nium chloride，CTAC)成功實現了蛋白質的促丨谷和重折疊 (Puriet al.，1992)。 即使是鹽濃度非常低的蒸餾水也能取得促溶效果(S o n g ， 2009)。

4. 重折疊

假設你已經按如下方法進行了重折疊實驗，那么最基本的稀釋變性劑的方法就是將溶解的蛋白質稀釋入合適的重折疊緩沖液中。然而，這 里 有 3 種方法可用于重折疊稀釋。

(1) 反向稀釋(reverse dilution) 將重折疊緩沖液加至變性蛋白質中，每次加時都要混 勻 。該方法已有數個成功的例子[如G r i b s k o v和 B u r g eSS(1983)]。然 而 ，仔細想想就會知道，這種稀釋方法無疑會在蛋白質開始重折疊的關鍵時期產生最髙的蛋白質濃度。例 如 ，如果蛋白質以I m g /m L 的濃度溶解于6 m o l /L 鹽酸胍，那么如果加入2?5 體積的重折疊緩沖液(稀 釋 至 1?2 m o l / L 鹽酸胍），就可能會在蛋白質濃度為 330?160 ug/mL時經歷重折疊的過渡狀態。

(2) 瞬間稀釋（flash dilution) 將變 性 蛋 白 質 快 速 加 入 重 折 疊 緩 沖 液 。例 如 ，將10 m L 6 m o l /L 鹽酸胍中的重折疊蛋白質一次性加入590 m L 的合適的重折疊緩沖液中以稀釋60倍, 同時快速混勻。在重折疊時, 蛋白質濃度會成為16ug/m L ，遠低于反向稀釋的水平，導致蛋白質聚集的可能性較小。

(3) 滴注稀釋(drip dilution) — 滴一滴地非常緩慢地將變性蛋白質滴人重折疊緩沖液中，滴加需要 I h 。理論上, 這應當是最佳的方法，因為蛋白質總是在極低的濃度下進行重折疊[參見S i n g h 和 P a n d a (2005) ,Vallejo和 Rinas(2004)的綜述]。例如，如果你將 0.1 m L 上述溶解的蛋白質滴入590 m L 重折疊緩沖液中，那么蛋白質濃度只有〇.16ug/m L。因為你滴入的樣品量增加得很少，所以蛋白質總是保持在低濃度, 而且當最后一滴被加人時，蛋白質濃度為16ug/m L。然而 ，如果變性蛋白質經過了 I h 的滴加，而且蛋白質有效地重折疊至天然狀態的半數重折疊時間只有1?3 m i n ，那么部分重折疊的黏性蛋白的濃度總是很低，因而它們就不會發生聚集。耗 費 i h ，一滴一滴加人溶解蛋白，這會讓人感到厭煩，但可以使用設置為極低流速的蠕動泵將變性蛋白質在I h 這段時間內加人。這樣做的重復性更好，而且顯著減少了研究生的精力消耗。
蛋白質稀釋后將其靜置30?60 m in，然后按常規流程中介紹的那樣進行過濾。否則 ，當將蛋白質溶液上樣至柱子 (見下文)時，非常小的顆粒狀的物質就可能會堵塞柱子，引起壓力升高，從而使實驗中途失敗，或是需要將流速降得很低以至于上樣就要花費數小時。

5. 高 分 辨 率 的 離 子 交 換 層 析

蛋白質經過重折疊和過濾后，最后一步的高分辨率離子交換層析柱用于完成 下 面 5項重要工作。

⑴ 濃 縮 蛋 白 質 ( 如 從 600 m L 濃 縮 到 4? 8 m L )

(2) 去除變性劑(在流穿液中）

(3) 去除次要的雜質(在流穿液中，或是與柱子的結合弱于或強于與目標蛋白質的結合) 如果使用高分辨的陰離子交換柱，如 p〇 R〇 s H Q 或 M〇 n〇 Q，任 何 D N A 污染物都會緊密結合在柱子上，使用〇 ? 6?〇 ? 9 mol/L 的 NaCl可以洗脫下來。如果非常希望在終產物中沒有大腸桿菌的脂多糖，可以在開始用鹽濃度梯度洗脫之前用異丙醇 (isopropanol)沖洗柱子以大大減少LPS。

(4)選擇均一的，有活性的單體如果有通過非重折疊技術純化的天然蛋白質的樣品，那么就能知道在同樣的離子交換柱上用何種鹽濃度可以將其洗脫。如果在相同的鹽濃度下，重折疊樣品洗脫出了一個主要的峰(peak), 那么就可以部分地確信該蛋白質得到了正確重折疊，因為如果使用的柱子具有高分辨率，那么錯誤折疊的分子可能會有(但不是一定的)略微不同的洗脫結果。

(5) 除去可溶的蛋白質多聚體在重折疊樣品中常有可溶的多聚體(見 本 章 5.7節）。如果你選擇的重折疊溶液很合適, 那么多聚體也可能會極少; 否則，它們會是重折疊產物的主要成分。這 些 可 溶 的 N 聚體與單體相比帶有JV倍的電 荷 。由于有更多的電荷 ，其傾向于與離子交換柱結合得更緊密，洗脫下來也更晚。如果蛋白質是用于結晶以測定結構，去除多聚體是很重要的一步, 因為不均一相的材料不大可能結晶。

以我的經驗，大多數情況下，從柱子中洗脫出的第一個主峰中的蛋白質都會是髙品質的、純的、具有完整生物活性的蛋白質。

6. 再 氧 化 以 形 成 正 確 二 硫 鍵

如果你的蛋白質不含半胱氨酸，這就不是問題。然 而 , 大部分蛋白質都含有半胱氨酸 ，而且許多都有作為三維結構重要組成部分的二硫鍵。由于大腸桿菌的胞質是還原性很強的環境，大部分內源蛋白質都處于還原狀態。如果你向裂解緩沖液中加入還原劑，如0.1? I rmnolZL的 D T T ，你通常可以使蛋白質保持在還原狀態，防止其在上述的再折疊的早期步驟中形成不想要的或不正確的二硫鍵。然而，只要你重折疊目標蛋白質，如果其能夠形成二硫鍵，你就必須在某些階段允許蛋白質的再氧化以形成二硫鍵。含有半胱氨酸 ，但一般不含二硫鍵的蛋白質中, 其半胱氨酸未處于形成二硫鍵所需的精確的幾何構型中 [見 A nthony等 (2002)]。因此，雖然經常會存在大量可能的錯誤的二硫鍵，但其并不會輕易形成。最好的策略是在氧化還原緩沖液(redox buffer) 中進行蛋白質的重折疊。這種緩沖液(見下文)含有還原劑和氧化劑的混合物，可 以 允 許 二 硫 化 物 發 生 「洗牌」(shuffling)[見 G ilbert(1994)]。二硫化物的「洗牌」是由二硫鍵反復形成和還原組成的。如果在錯誤折疊的蛋白質中形成了不正確的二硫鍵而且不能被還原，蛋白質就會被凍結在錯誤構象而不能達到天然狀態。如果這個二硫鍵得以還原，蛋白質就會繼續在半折疊中間狀態之間變化，直到形成正確結構。如果形成了正確的鍵, 它就可以穩定最終的天然蛋白質。即使偶爾被還原，蛋白質也會處于穩定狀態，而且通過再氧化又能形成正確的
鍵 。因為這個原因，僅在溶解緩沖液中而不在重折疊緩沖液中加入還原劑, 常常也可以取得成功。重折疊后，可以使蛋白質經歷緩慢的空氣氧化(在空氣中 暴 露 1?2 天），常常能獲 得正確的二硫鍵結構。關 于 更 多 的 再 氧 化 的 內 容 可 見 V allejo和 Rinas(2004)及Kirsten 和 Raines(2003)的文獻。

形成二硫鍵的一些經典方法如下所述。

(1) 空氣氧化 不 加 還 原 劑 暴 露 在 空 氣 中 數 天 。

(2) 氧化還原緩沖液 如 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (G S H )/氧化性谷胱甘肽(G S S G )(10/1，3 m m o l / L G S H /0. 3 m m o l / L G S S G )。有多種氧化還原對(redox pair) 在使用，它們包括還原型谷胱甘肽(G S H ) 和氧化型半胱氨酸、二硫蘇糖醇 (D T T )和谷胱甘肽。為了取得最佳的二硫化物的再氧化效果，還原形式與氧化形式的摩爾比有時是不同的。

(3) 蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，P D I ) 該 酶 可 以 催 化 二 硫 化物 的 「洗 牌 」（Kersteen and Raines, 2003)。也 可 以 使 用 小 分 子 P D I 類 似 物（m i m i c s)(W o y c e c h o w s k y e t a l .，1999)。

7.鑒 定

在 瀏 覽 涉 及 重 折 疊 的 論 文 時 ，我 發 現 最 常 見 的 問 題 是 研 究 者 不 知 道 他 最 終 得 到 的 蛋白 質 是 否 進 行 了 正 確 的 折 疊 、是 否 是 單 分 散 性 的 (monodisperse) 以 及 是 否 具 有 完 整 的 生物 活 性 。常 見 的 方 法 是 酶 學 分 析 或 生 物 學 分 析 , 但 通 常 沒 有 任 何 標 準 。你 可 以 見 到 諸 如「由 于 終 產 物 具 有 活 性 ，這 顯 示 其 進 行 了 正 確 的 折 疊 而 且 具 有 完 整 的 活 性 」這 樣 的 描 述 。然 而 只 有 與 已 知 的 、具 有 完 整 活 性 的 標 準 品 進 行 比 較 后 才 能 評 估 終 產 物 具 有 多 少 活 性 。沒 有 比 較 ，你 只 能 知 道 其 有 活 性 ，但 無 法 確 定 活 性 蛋 白 質 的 百 分 比 是 1〇 〇 %、1〇 %、〇. 1 %還 是 0. 0 1 % 。如 果 可 能 的 話 , 對 重 折 疊 過 程 所 得 到 的 終 產 物 的 特 異 性 與 活 性 進 行 這 種 定 是 必 須 的 。

另 有 一 項 重 要 的 鑒 定 是 確 定 重 折 疊 蛋 白 質 的 大 小 。是 單 體 (單 分 散 性 )還 是 含 有 大 量可 溶 的 多 聚 體 [非 均 相 分 散 (heterodisperse)] 。 晶 體 學 家 通 常 使 用 動 態 光 散 射 (dynamiclight SCattering，D S L ) 來 確 定 純 化 的 、重 折 疊 或 未 重 折 疊 的 蛋 白 質 是 否 是 單 分 散 性 的 。另一 個 方 法 是 由 加 利 福 尼 亞 州 L a Jolla市 的 諾 華 研 究 基 金 會 基 因 組 研 究 所（G enomicsInstitute of the Novartis Research Foundation，G N F )的 M a r k K n u t h 開 發 的 ，利 用 分 析 性分 子 篩 色 譜 技 術 (analytical size exclusion chromatography，A N S E C )分 析 終 產 物 。我們
發 現 該 方 法 非 常 有 用 ，因 為 即 使 非 常 少 量 的 蛋 白 質 也 能 用 該 法 分 析 。通 常 ，我 們 用 12 m L的 S h o d e x K W -802. 5 柱 子 和 含 有 0. 25 m o l / L N a C l 的 緩 沖 液 ，以 0. 5 ? 1. 0 m L / m i n 的流 速 分 析 20? 5 0 ug 的 樣 品 ，同 時 監 測 280 r n n 和 215 n m 的 紫 外 線 吸 收 。 當 柱 子 用 合 適的 分 子 質 量 標 準 進 行 校 準 后 ，就 可 以 快 速 地 確 定 大 部 分 蛋 白 質 是 否 處 在 所 預 測 大 小 的 單體 形 成 的 單 一 的 峰 內 (單 分 散 性 , 好 情 況），或 者 大 部 分 蛋 白 質 是 否 更 早 地 被 洗 脫 ，這 意 味著 多 聚 體 的 形 成 導 致 其 分 子 質 量 較 大 (非 均 相 分 散 ，糟 糕 的 情 況）。這 一 步 驟 的 分 析 是 一套 完 整 的 重 折 疊 測 試 實 驗 的 重 要 組 成 部 分 (見 下 文 ) 。

不 能 用 圓 二 色 譜 (circular dichroism，C D )或 免 疫 印 跡 ( Western Blot)分 析 確 定 活 性或 單 分 散 性 。大 量 的 實 例 表 明 ，有 許 多 蛋 白 質 與 天 然 的 標 準 品 具 有 非 常 相 近 的 或 相 同 的C D 譜 ，而 且 在 免 疫 印 跡 分 析 中 結 果 很 好 ，但 其 實 不 具 備 單 分 散 性 或 者 不 具 有 活 性 。

三、蛋白質重折疊條件的篩選實驗

1. 系統的重折疊篩選

在 前 面 所 述 的 常 規 流 程 以 及 討 論 中 , 我 們 假 設 已 經 知 道 了 針 對 目 標 蛋 白 質 的 合 適 重折 疊 溶 液 。然 而 ，這 是 設 計 有 效 的 重 折 疊 方 案 時 最 不 可 缺 少 也 是 最 困 難 的 部 分 。在 早 期敘 述 的 蛋 白 質 重 折 疊 論 文 中 ，通 常 只 選 用 一 種 重 折 疊 溶 液 ，它 或 者 有 效 或 者 無 效 。那些 有效 的 就 發 表 出 來 ，而 無 效 的 則 通 常 舍 棄 。這 導 致 的 結 果 就 是 早 期 成 功 進 行 重 折 疊 的 蛋 白
質 是 那 些 通 常 在 許 多 不 同 的 條 件 下 都 能 很 容 易 地 重 折 疊 的 蛋 白 質 。近 年 來 ，人 們 越 來 越明 白 許 多 蛋 白 質 只 能 在 非 常 特 殊 的 條 件 下 才 能 重 折 疊 。挑 戰 已 經 變 為 如 何 對 許 多 可 能 的條 件 進 行 篩 選 以 從 中 挑 選 出 能 有 效 地 促 進 蛋 白 質 重 折 疊 的 條 件 。最 重 要 的 一 個 進 展 是 使用 部 分 因 子 原 理 (fractional factorial approach)去 系 統 地 確 定 許 多 不 同 變 量 的 影 響 (A r m -
strong et a L , 1999; C o wieson et al.， 2006; Quronfleh et al., 2007; TTre saugues et al.，2004; Vincentelli et al.，2004;Willis et al., 2005)。

已 經 開 發 了 數 種 商 業 化 的 產 品 用 于 幫 助 研 究 者 鑒 定 合 適 的 蛋 白 質 重 折 疊 條 件 。關于蛋 白 質 重 折 疊 條 件 篩 選 和 相 關 操 作 方 案 的 更 多 信 息 可 參 考 下 面 的 公 司 網 站 。

A t h e n a E S QuickFold? (15-solution kit), http：//w w w .athenaes.c o m /QuickFoldProteinRefolding Kit；

EMD/Novagen， s iF0LDl? 、 iF0LD2? 和 iFOLD3?(96-solution kit), http:,//www. novagen. com;

Pierce Biotechnology’s ProMatrix? ( 9 6 -solution kit c o m p o n e n t s ) ， http://w w w .fishersci.c o m 。

隨 著 這 種 篩 選 技 術 使 用 經 驗 的 積 累 和 新 的 輔 助 方 法 的 鑒 定 , 這 個 名 單 很 可 能 會 變 長 ，篩 選 技 術 也 會 繼 續 進 步 。必 須 注 意 的 是 , 對 于 那 些 買 不 起 這 些 昂 貴 試 劑 盒 的 研 究 者 來 說 ，沒 有 什 么 可 以 阻 止 他 們 設 計 一 套 自 己 的 測 試 溶 液 及 制 訂 自 己 的 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 方 法 以滿 足 他 們 特 殊 的 需 求 ，這 里 的 關 鍵 是 系 統 的 平 行 篩 選 多 種 重 折 疊 條 件 。

2.重折疊中的變量

存 在 許 多 的 溶 液 變 量 (如 P H 、溫 度 、鹽 濃 度 、氧 化 還 原 環 境 和 二 價 離 子 的 存 在 )和添加 劑 (additive) (已 有 報 道 顯 示 它 們 能 夠 提 髙 溶 解 的 包 涵 體 蛋 白 的 重 折 疊 效 率 )。在 設 計前 面 提 到 的 商 業 化 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 產 品 時 已 經 考 慮 到 了 這 些 變 量 和 添 加 劑 ，它 們 也 為那 些 想 要 設 計 自 己 的 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 方 法 的 研 究 者 提 供 了 示 例 。下 面 討 論 了 這 些 變量 。其 他 的 關 于 蛋 白 重 折 疊 的 綜 述 對 其 中 一 些 變 量 有 更 詳 細 的 討 論 (A r m s t r o n g et a L ，1999； C o w i e s o n et al.> 2006； Middelberg； 2002； Quronfleh et al.> 2007； Schein> 1991；Singh and P a n d a , 2005; Tresaugues et al., 2004； Vallejo and Rin a s, 2004； Vincentelli
et a l , 2004； Willis et al., 2005)

(1) p H 大 部 分 蛋 白 質 重 折 疊 在 p H 5 ? 9 內 完 成 ，在 我 們 實 驗 中 ，大 部 分 蛋 白 質 在p H 8? 8. 5 時 重 折 疊 效 果 最 好 。 一 般 來 說 ，所 使 用 的 p H 距 蛋 白 質 等 電 點（蛋 白 質 不 帶 凈電 荷 ，最 傾 向 于 沉 淀 時 的 p H )至 少 相 差 一 個 單 位 是 個 不 錯 的 想 法 。

(2) 溫 度 目前，沒有明顯的趨勢表明有任何廣泛適用的最佳蛋白質重折疊溫度。大部分研究者在接近 室 溫 的條件下進行蛋白質重折疊。這個溫度對于 防 止 蛋白質的熱損傷足夠低，對于增加分子的熱力學運動又足夠高, 分子的熱運動對于溶解瞬時錯誤折疊構象和達到天然構象可能是非常重要的。有人也許會說更髙的溫度會加強可能導致聚集的疏水相互作用，但它也會加強將疏水殘基埋在天然構象內部時所需的疏水相互作用。

Xie和 Wetlaufer(1996)發表了一篇非常有趣的文章, 該文涉及在4 m g / m L 的蛋白質濃度下， I m o l / L G u H C l 和 50 m m o l / L Tris 硫酸 (Tris sulfate)，p H 7. 5 的條件下，在不同溫度下重折 疊 碳 酸酐 酶 IKcarbonic anhydrase II) 。其 結 果表明在低溫(4? 12°C)下重 折 疊 120 min, 然后溫度「跳躍」（temperature*leap)至 36°C并 持 續 30 min，這樣可以得到非常好的酶活回收率(>9 〇 %)。他們認為在低溫下疏水相互作用會被減小，從而盡可能的降低了聚集作用，同時允許蛋白質緩慢的轉變為一種無活性的或無聚集傾向的中間體 。當溫度從 4°C「跳躍」至 36°C 時，這種中間體就會轉化為有高活性的天然形式。

(3) 鹽 濃 度 可 能 需 要 某 些 鹽 來 起 到 「鹽 溶 』』 (salting in) 作 用 以 增 加 天 然 蛋 白 質 的 可溶 性 (見 本 書 第 20 章）。 通 常 使 用 50? 100 m m ol/L 的 鹽 。在 對 6 m ol/L 鹽 酸 狐 稀 釋 60倍 時 ，鹽 酸 胍 的 終 濃 度 就 變 為 〇. I m ol/L。 為 了 不 影 響 與 合 適 的 離 子 交 換 層 析 柱 的 結 合 ，通 常 避 免 加 入 其 他 鹽 以 使 鹽 濃 度 就 保 持 在 足 夠 低 的 水 平 。

(4) 氧 化 還 原 試 劑 前面關于再氧化的章節已經討論了使用氧化還原緩沖液輔助二硫鍵的形成。在一些商業化試劑盒中，包含有無還原劑溶液、有還原劑溶液，以及含有不同比例的還原劑和氧化劑的氧化還原緩沖液。

(5) 二價陽離子 該 變 量 還 未 經 過 全 面 的 探 索 研 究 ，但已知天然蛋白質通常含有二價陽離子(如 M g 2+ 或 Z n 2+ ) 作為其結構的一部分。顯 然 ，任何能夠穩定蛋白質天然結構的因素都會利于重折疊向天然構象的方向進行，而遠離蛋白質的聚集。

(6) 精 氨 酸 和 其 他 氨 基 酸 有 大 量 的 文 獻 描 述 了 使 用 精 氨 酸 (arginine) 來 促 進 溶 解蛋 白 的 重 折 疊 ，以 及 解 釋 其 如 何 減 弱 了 聚 集 作 用（A r a k a w a et al.，2007; Baynes et al.，2005; D a s et al.，2007; D o n g et al.，2004; R e d d y et al.，20 〇 5) 。似 乎 精 氨 酸 可 以 通 過 降低 蛋 白 質 間 相 互 作 用 的 速 率 來 減 弱 聚 集 作 用 。 D a s 等 認 為 這 是 由 于 精 氨 酸 在 溶 液 中 形 成了 超 分 子 組 裝 體 (supramolecular assembly) 。其 缺 點 之 一 是 通 常 在 0. 5 ? 1. 0 m o l /L 濃度 下 使 用 ，這 也 是 其 最 有 效 的 范 圍 。如 果 不 經 稀 釋 或 透 析 ，此 濃 度 就 會 妨 礙 后 續 的 Ni2+ 螯合 親 和 層 析 柱 色 譜 ，并 會 阻 止 大 部 分 蛋 白 質 與 離 子 交 換 層 析 柱 的 結 合 。已 經 發 現 天 然 的 滲
透 保 護 劑 (osmoprotectant) 脯氨酸有時無論在體夕卜還是體內也能增強蛋白質可溶性。

(7) 甘 油和糖 [ 蔗 糖 、甘露糖醇(mannitol)、山梨糖醇(sorbitol) 和 海 藻 糖 (trehalose)]我 們 已 經 發 現 在 許 多 時 候 甘 油 都 是 非 常 好 的 蛋 白 質 重 折 疊 添 加 劑 ，通 常 的 使 用 濃 度 為5 % ? 3 0 % 。 S h i m a m o t o 等 (1998) 使 用 的 一 個 極 端 的 方 法 涉 及 將 包 涵 體 用 6 m o l /L 鹽 酸胍 溶 解 至 2?10 m g /m L ，加 入 甘 油 至 5 0 % (V /V ) ，在 7 5 % 甘 油 中 透 析 以 除 去 變 性 劑 , 然后 快 速 稀 釋 至 5 % ? 1 0 % 的 低 甘 油 濃 度 。 已 經 發 現 一 些 糖 為 〇. 5 ? I.5 m o l /L 時 能 成 功地 促 進 蛋 白 質 重 折 疊 ( B o w d e n and Georgiou, 1988)。

(8) 其 他 化 學 添 加 劑 大量的各種各樣的論文報道使用諸如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG ) (Cleland et al.， 1992)、環糊精（cyclodextrin) (Rozema and Gellm an， 1996)，以及各種非去污劑橫酸甜菜喊（nondetergent sulfobetaine，NDSB) (Expert-Bezancon etal.， 2 0 0 3 ) 這樣的物質來促進特定蛋白質的重折疊。有報道稱特定的離子液體(i 〇 nic liquid) (如熔點低于 100°C 有機鹽）， 例 如 ，A T -烷 基 N - 甲 基咪唑氯化物 (N’-alkyl-N -m ethylimidazolium chloride)可作為重折疊添加劑（Lange et al.， 2005)。乙基（e th y l)和丙基衍生物 (propyl derivative)在 0?5 ? I. 0 m ol/L 的 濃 度 下 表 現 出 了 與 左 旋 精 氨 酸 (L-arginine) 相當的增加蛋白質活性和重折疊產量的作用。

(9) 去 污 劑 理論上, 去污劑在重折疊時應該可以幫助阻止聚集作用。在低濃度下，它們與暴露的疏水區或黏性區微弱結合，并將其掩蓋，從而阻止聚集作用。當它們的濃度降低時，就會從蛋白質解離從而允許蛋白質天然構象的形成。這被認為是十二烷基肌氨酸鈉能夠很好地起作用的原因。在高濃度下，其為變性劑，在低濃度下其就作為人工分子伴 侶 ，阻止了聚集作用從而促進重折疊。

(10) 離液劑（chaotropic a g e n t)( 高濃度下 的 變 性 劑）由 于 聚 集 作 用 是 由 部 分 折 疊的 中 間 體 之 間 的 相 互 作 用 導 致 的 , 有 時 在 重 折 疊 溶 液 中 加 人 非 變 性 劑 量 的 離 液 劑（chaotrope) 對 解 離 聚 集 體 是 有 用 的 ，同 時 不 會 損 傷 更 穩 定 的 天 然 結 構 。常 用 I m 〇 l/L 尿 素 和
0.5 m o l /L 鹽 酸 胍 。

(11) 目 標 蛋 白 質 特 異 的 添 加 劑 如 同 前 面 關 于 特 定 二 價 陽 離 子 的 潛 在 好 處 的 論 據一 樣 ，諸 如 合 適 的 底 物 、輔 因 子 (cofactor) 、或 必 需 的 血 紅 素 基 團 ( h e m e gro u p) 等 物 質 的 存在 可 以 穩 定 目 標 蛋 白 質 天 然 結 構 , 提 高 其 重 折 疊 產 量 。

3. 一個實用的、經濟的、合理的方法

有了所有的重折疊篩選方法，你還必須獲得某種讀出（readout)來顯示哪種條件最有效 。最好的情況是你的目標蛋白質是已知的酶，且很容易分析。你只需將你溶解的蛋白質稀釋至不同的重折疊緩沖液中, 等待一些時間以完成重折疊(通常為數小時），然后取一部分稀釋的溶液分析其酶活性。

如果你想檢測各種條件對重折疊 GFP 這樣的熒光蛋白的影響就更簡單了，因為只有當 GFP 折疊正確時熒光才能恢復，而且在折疊中和折疊后也很容易通過合適的熒光平板讀取器進行測量。這給蛋白質重折疊的教學提供了非常好的訓練方法，并且已被用于冷泉港的蛋白質培訓課程中(R .Burgess、N. T h o m p s o n 、R . C h u m a n o v ，未發表的結果）。

然而，近來研究的大部分蛋白質既不是酶，也沒有簡單的生物學分析方法。如何知道哪種重折疊條件效果最好呢，下面的操作方案已經被使用并取得了巨大成功的 (R. C h u -m a n o v 和 R. Burgess, 未發表的結果）。 該操作流程相當普通, 利用了蛋白質聚集導致的溶液的渾獨（Tre’saugues et al.， 2004; Vincentelli et al.， 2004)。

(1) 準備洗滌過的包涵體，溶解于前面提到的