《Nature》于2019年末選出了其創刊150年歷史上出版過的最具有歷史影響力的10篇論文,其中包括劍橋大學的阿根廷生物學家César Milstein(色薩·米爾斯坦)和德國生物學家Georges J. F. K?hler(喬治斯·科勒)在1975年發表的文章。他們提出的利用雜交瘤細胞生產單克隆抗體(monoclonal antibody)的方法, 為此后半個世紀的免疫學以及癌癥和自身免疫性疾病治療的醫學研究提供了重要的工具和思路。當時德國科隆大學(Universit?t zu K?ln)的免疫學家Rajewsky 在為Nature 撰寫的新聞稿中這么評論道:“我當時立刻意識到我們的研究領域迎來了一個轉折點。”
1975年，Nature報道了如何制造能產生已知特異性抗體的細胞系。這一發現導至了在治療自身免疫疾病和癌癥方面的重要生物學發現和臨床上的成功進展。抗體由B淋巴細胞產生, 可以特異性結合病原抗原并阻斷病原侵染。1890 年, 德國生理學家Emil von Behring 和日本微生物學家Shibasaburo Kitasato在暴露于白喉毒素和破傷風毒素的動物血液中發現一種可以中和毒素的物質, 并將其命名為抗體(antibody)。他們引入“抗體”一詞來泛指抗毒素物質，在醫學實踐中, 抗血清一直被用于傳染病的被動免疫療法或者檢測工具。然而, 由于血清抗體的多克隆性及效價不穩定, 這些方法的效果不一, 還常受到過敏反應和血液傳播病原體風險增加等問題的限制。同時，與他們合作的德國科學家Paul Ehrlich受當時關于酶與底物結合的“鎖鑰學說”啟發, 提出抗體與毒素抗原相結合也是基于類似的化學結構原理。20 世紀20 年代, 美國免疫化學家Michael Heidelberger 和美國微生物學家Oswald Avery發現抗原可以被抗體沉淀,并揭示抗體的化學本質是蛋白質。 1948 年, 瑞典免疫學家Astrid Fagreaus發現由B 細胞分化而成的漿細胞是產生抗體的效應細胞。自被發現開始,抗體便成為了科學界一個經久不衰的研究熱點。人們發現, 抗體在適應性免疫(adaptive immunity)中發揮著不可替代的核心作用, 并驚訝于抗體對各類抗原(antigen)分子兼具高度親和力及高度特異性的結合能力。然而, 想要得到識別特定單一抗原的抗體十分困難。以當時的技術, 人們希望獲得可以特異性識別流感病毒的抗體, 就需要用滅活的流感病毒來免疫模式動物(例如小鼠或兔子), 一段時間后從被免疫動物的血清中分離抗體。由于血清中大量不同抗體的存在, 這樣獲得的抗體成分中能夠特異性結合流感病毒的一般只有0.5%~5%, 不僅特異性低, 而且可重復性也難有保障。即使使用親和層析技術也無法純化流感病毒特異性的抗體, 因為親和層析無法分離針對同一抗原不同表位(epitope)的抗體。這樣純化出來的抗體也會是成千上萬種針對不同表位抗體的混合物, 也就是所謂的多克隆抗體(polyclonal antibody)。這種多克隆抗體在科研臨床應用有限。20 世紀60 年代, 多發性骨髓瘤(multiple myeloma)被人們發現。作為一種漿細胞來源的腫瘤, 它在人體內可不受控制地無限增殖。由于骨髓瘤細胞保持了漿細胞高效率分泌抗體的特性, 因此多發性骨髓瘤患者的血清和尿液中可以檢測到大量被稱為paraprotein 的抗體和抗體片段(多為IgA、IgG、λ 輕鏈和κ 輕鏈)。研究者利用骨髓瘤細胞的這一特點對抗體進行了更深入的研究, 雖然這些抗體還并非是針對單一抗原表位的單克隆抗體, 但是人們借此對抗體的生化基礎有了更深的了解。腫瘤免疫學家MichaelPotter 發現, 在特定品系的小鼠體內注射礦物油可以誘發小鼠產生骨髓瘤,這為骨髓瘤和抗體研究提供了動物和細胞模型。1974 年, 畢業于瑞士巴塞爾免疫學研究所(Basel Iustitute for Immunology)的K?hler 作為一名博士后加入了Milstein在劍橋大學的實驗室。當時細胞融合技術正熱門, Milstein的團隊嘗試在一些小鼠骨髓瘤細胞系以及各種其他細胞(例如成纖維細胞)之間進行細胞融合。然而細胞融合后雜交細胞分泌的抗體特異性不佳。恰好K?hler 在巴塞爾免疫研究所攻讀博士時了解到, 當時的研究所所長Niels Jerne 開發了一種可以篩選分泌單一抗體漿細胞的方法,即通過含有綿羊紅細胞(sheepred blood cell, SRBC)的瓊脂平板上的斑塊(plaque)來篩選分泌針對SRBC單一抗原抗體的漿細胞。分泌識別SRBC 抗體漿細胞團簇周圍的紅細胞會因為抗體結合后的作用而發生細胞裂解, 從而形成一塊肉眼可見的沒有紅色斑塊的區域。但是由于缺乏永生性,這些能夠分泌單一性抗體的漿細胞無法被培養, 進而無法實現抗體的大規模生產。因此, K?hler 和Milstein 想到, 如果能夠將分泌單一抗體的漿細胞和無限增殖的骨髓瘤細胞融合, 就可以一舉解決穩定持續大量地生產單一性抗體這一難題。K?hler 和Milstein 的實驗設計獲得了成功——當他們把注射了SRBC 的小鼠脾臟細胞取出, 與P3-X67Ag8骨髓瘤細胞系融合, 并在含有SRBC 的瓊脂平板上培養后,在沒有紅色斑塊的區域分離出了大量既像漿細胞一樣分泌抗SRBC 抗體又像骨髓瘤細胞一樣具有永生性的融合細胞。在他們使用的HAT 培養基中, 由于氨基蝶呤(aminopterin)阻斷了DNA 核苷酸的從頭合成途徑, 細胞必須利用自己的DNA 核苷酸補救合成途徑以及培養基中的次黃嘌呤(hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)才可以生存。但是這里使用的骨髓瘤細胞系缺少DNA 補救合成途徑中的必要酶, 即次黃嘌呤- 鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase, HGPRT), 因此無法正常增殖, 脾臟細胞則本身不具有永生性。這樣, 能夠在他們設置的培養條件下正常增殖的細胞, 必然是既擁有HGPRT, 可以正常合成DNA, 又具有無限分裂特性的融合細胞。當然他們這樣設計的實驗能夠成功, 有一定運氣,后來人們知道骨髓瘤細胞明顯傾向于和脾臟細胞融合, 而不是發生自體融合。K?hler 和Milstein 培養出的融合細胞被稱為第一代雜交瘤(hybridoma)細胞, 可以進行無限的培養、增殖和抗體分泌。但是在技術層面, 由于他們當時使用的P3-X67Ag8骨髓瘤細胞系會內在性地分泌自身基因組編碼的抗體, 因此第一代雜交瘤細胞分泌的漿細胞來源特異性抗體中會摻雜骨髓瘤來源的非特異性抗體。不過很快地, 一類不會內在性地分泌骨髓瘤來源非特異性抗體的X63-Ag8.653 骨髓瘤細胞系被免疫學家Rajewsky 的研究團隊成功分離。使用X63-Ag8.653 骨髓瘤細胞跟來自脾臟的漿細胞進行融合,很好地解決了第一代雜交瘤細胞培養上清中兩種抗體混雜的問題。從此,可以高度特異性結合人們需要的各類抗原的單克隆抗體終于可以在體外被制造出來, 并在實驗室研究和醫療應用中得到了極大的應用。 1984 年, Milstein、K?hler 和發現骨髓瘤誘導產生方法的Potter 被授予生物醫學領域知名的拉斯克獎, 同年的諾貝爾生理學或醫學獎則被頒給Milstein、K?hler和發明平板篩選SRBC 特異性抗體方法的Jerne。
非常值得一提的是,劍橋大學Milstein 實驗室在單克隆抗體技術投入應用后毅然放棄了這些技術的ZL權, 使得全世界的研究者和病人不需要支付額外的ZL費用就可以享受使用單克隆抗體技術生產的試劑和藥品。為此,Milstein 曾說過, “只有當世界上真正窮苦的人們也能平等地分享科學帶來的好處時, 科學才算是兌現了它的諾言”。 Milstein 的義舉, 在物質至上的社會, 也的確引起一些爭議。后來有推測或許是因為Milstein出生于1927 年社會動蕩的阿根廷,這些成長早期的社會經歷使得Milstein真正理解并不寬裕的廣大人民群眾對科技進步帶來的相關成果的急迫需求。
自小鼠雜交瘤技術誕生以來,單克隆抗體技術在過去45 年間取得了長足的發展。其中, 最顯著的是多種各具特色的抗體篩選技術的出現, 為制備單克隆抗體提供了更多的選擇。此外, 強烈的臨床需求還催動了更高效的以人源抗體為目標的單克隆技術的發展。噬菌體展示技術作為第一種可以高通量篩選對特定病原體反應抗體的創新方法, 其主要技術流程包括: 從被免疫或感染后的人體外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)提取細胞總RNA, 并反轉錄成cDNA; 通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因片段, 隨后將擴增的基因片段隨機克隆形成組合文庫; 將組合文庫導入絲狀噬菌體(filamentous bacteriophage)與外膜蛋白融合表達; 用固相化抗原直接、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體基因序列, 經體外加工形成全人源抗體。這個技術為抗體定向演化提供了全新策略, 從根本上改變了傳統雜交瘤技術制備流程, 一次篩選可獲得針對同一抗原不同表位的多種抗體, 縮短了實驗周期并增加了穩定性。因此, 噬菌體展示技術于2018年被授予諾貝爾化學獎。但該技術也有明顯缺點: 它對抗體蛋白的修飾和折疊與人體細胞差別很大, 一定程度上影響了抗體的親和力。因此, 噬菌體展示技術獲得的抗體往往還需要人工優化。酵母展示技術實現了從原核表達系統到真核表達系統的進步。酵母菌具有折疊酶、分子伴侶、內質網等, 在蛋白質的折疊和分泌機制方面與高等哺乳動物相似, 基于此建立起來的酵母表面展示技術可用于展示糖基化和二硫鍵異構化等修飾的真核生物蛋白質, 有助于提高展示抗體的穩定性和抗原結合能力。并且, 利用流式細胞技術還能對表達抗體的酵母顆粒進行分選, 達到高效、快速的篩選和分離。不過酵母的蛋白質修飾系統與人體依然有不小的差異, 這對抗體功能仍存在一定影響。中國倉鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)細胞是目前用于真核基因表達的最成功的哺乳動物細胞, 在生物工程上被廣泛應用。與噬菌體展示技術相比, 外源蛋白更易在CHO 細胞中合成并分泌到培養基; 重組蛋白能夠正確折疊、修飾、組裝多亞基蛋白, 并且其理化性質、生物學性質幾乎與天然蛋白相似, 這在生物技術的發展中具有很高的應用價值。但外源基因在CHO 表達系統中的表達效率比在酵母展示系統中低且重組蛋白的生產成本較高。核糖體展示技術由Plückthun 實驗室于1997 年建立。該技術通過PCR 擴增淋巴細胞cDNA 中的VH 和VL 基因并引入體外表達元件方式構建文庫, 然后在體外無細胞體系中轉錄和翻譯。由于構建模板時3′端序列不含有終止密碼子, 因此體外翻譯時核糖體停留于mRNA 的3′端, 使文庫基因的翻譯產物展示在核糖體表面, 形成“蛋白質-核糖體-mRNA”三元復合物。最后用靶抗原反復篩選復合物、分離mRNA、逆轉錄富集目的基因, 從而獲得特異性的單克隆抗體序列。與其他展示技術相比, 核糖體展示具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強、篩選方法簡便、無須選擇壓力, 還可通過引入突變和重組技術來提高靶標蛋白的親和力等優點, 是一種篩選大型文庫和進化抗體強有力的方法。如何進一步提高該系統的穩定性, 防止mRNA 降解, 則是該技術需要解決的關鍵問題。
