單細胞技術分類及應用（一）

2019年10月22日，Biogen與日本Eisai宣布，經與FDA協商，計劃于2020年初向FDA提交Aducanumab治療阿爾茲海默癥（AD）的上市申請。如果獲批，Aducanumab將成為首個逆轉疾病進展的AD藥物。從技術角度看，Aducanumab也將有可能成為首個單B細胞測序來源的抗體藥物。正如Aducanumab一樣，越來越多的處于研發階段的抗體候選藥物來自單細胞技術。不僅僅是藥物研發，在科學研究上隨著科學家對于復雜生命體和生命現象的研究日趨深入和細化，他們也不再滿足于僅僅研究細胞均一群體拿到細胞之間共性的均一化數據，而是越來越重視同一細胞群體內單個細胞之間的差異性認識和理解，從而幫助我們對從宏觀到微觀的生物學調控過程和機制有更為精準和深刻的認識。因此可以說當前單細胞層面的研究在生命科學各個領域、各個層面都逐漸成為重要的研究模式。

從技術角度來看，單細胞研究檢測平臺通常需要同時結合細胞分離技術和單細胞分泌物分析檢測技術，尤其是第一步單細胞分離的操作方法因不同的研究需要而有所區別。常規對于能夠確定分選所涉及的標志物以及標志物能夠被直接檢測的情況，一般利用流式分選技術FACS即可實現大量細胞和復雜樣本的單細胞分選，并且通量較大（可做到384孔板），但是有所顧忌的是高速高壓的流式分選環節對細胞活性會造成的影響以及FACS并不具備操控某個特定目標細胞或者動態跟蹤觀察單個細胞的能力，至于其他的單細胞分離分析的方法，例如顯微成像、毛細管電泳等，具備精準分析單細胞的組分和結構的優勢，但是檢測通量卻較低。

因此，一種新型單細胞分離技術的開發，希望他不僅能夠兼顧在分離后檢測靈敏度，檢測時長，通量，樣品消耗量等難題的克服，而且可滿足實時動態追蹤單細胞活動信息，實現微量人體細胞樣品的單細胞分選及分析檢測成為當前緊迫的任務和挑戰。微流控技術是指使用微米級別的流體通道精確操控微升、毫升級別體積樣品的技術。這種結合微流設備和芯片的的微流控技術在經過很長時間的發展和改進，已實現商業化運用。目前主流且商業化主要是微流控技(Lab-on-a -Chip) 的單細胞平臺。今天小編將主要介紹兩種主流的微流控技術包括液滴技術Droplet及微反應室技術Microchamber的單細胞技術平臺。

基于微流控的液滴生成技術（圖1）是通過水溶液和油相從不同的微通道中流出并融合，形成一個“油包水”的乳液滴。將液滴技術運用到單細胞分離技術中即將單個細胞、反應試劑等通過微滴生成裝置包被在一個油滴中形成油包水的單細胞微反應體系，從而滿足多種單細胞的研究需求。

圖1 液滴分離技術流程圖。A 樣品導入模塊：包含有細胞以及熒光染料等試劑的兩路獨立管道；B 細胞及熒光染料等試劑融合模塊；C 細胞和熒光試劑的液滴混合模塊；D 細胞與染料試劑充分接觸和作用模塊；E液滴進入檢測器檢測分析模塊

關于微流控液滴技術，目前市場上的代表產品有HiFiBiO的自動化細胞發現平臺CelliGO以及英國Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine單細胞分析系統等。一般是通過微液滴技術將抗體分泌的B細胞包封在含有生長培養基的液滴中，當單細胞在單個微滴中分隔時，確保單克隆性，并且捕獲其分泌的分子如抗體以及和一些熒光二抗提前混合入微滴內，可以進行包括蛋白質分泌速率，滴度和抗原特異性等測定，應用在單細胞基因組測序和重組免疫球蛋白表達，抗體發現、細胞系開發等領域。

如圖2所示，小鼠免疫后分離和富集抗體分泌的B細胞，并使用微流控裝置將其分成一個個40pl的液滴。液滴來源于兩路水相，一路包含細胞或校準抗體，另一路包含有磁性納米粒子和熒光標記檢測用試劑。創建后,液滴被加載成二維陣列形式靜置到一個觀察腔室中,開始為IgG的分泌以及親和力分析測定準備。每個微滴中包含有預先涂有抗小鼠kappa輕鏈V_HH的磁性納米顆粒，它可以將抗體捕獲到beads上，最終因為親和力的作用，抗原蛋白（綠色）以及紅色熒光二抗IgG(Fc)都會與beads上包被的固定抗體的IgG片段結合從而實現檢測。

圖2 Droplet微液滴技術在抗體發現中的應用原理及流程

談到微滴技術不得不跟大家再分享下最近在單細胞測序領域比較火的10X Genomics公司，他們主要是基于微流控液滴技術的建立的一個高通量單細胞轉錄組測序建庫平臺，前陣子10X Genomics和Bio-Rad有ZL沖突的也正是由于droplet技術中的部分技術因素原因，所以目前他們開發了一種新的創造液滴的手段，但是本質原理是應該沒有變化的。主要由兩個核心技術組成除了下圖中油包水滴的微反應環境的創建，還有創新性的巧妙在樣品單細胞分離同時做Barcoding技術。

圖3 基于微液滴技術的高通量單細胞轉錄組測序建庫平臺

10X Genomics創立之初，是為了解決當時二代測序讀長過短的難題，所以最初的技術原型，是將10kb左右的DNA片段，通過這個微流控混合的設計，分配到各個液滴中去。各個液滴懸浮在油環境中，互不干擾，形成成千上萬個平行的反應微體系。在每個液滴中含有能夠捕獲DNA的Gel Bead，上帶有相同的長為16bp的Barcode，以及10bp左右，序列隨機的UMI（Unique Molecular Identifiers），用于標記每一段起始的DNA或RNA模板。從而判斷在測序中測得的相同序列，是來自于建庫過程中的PCR擴增產物，還是不同的RNA/c-DNA模板，也就是消除PCR bias，這些對于基因表達量的量化統計至關重要。在測序完成后，可以判斷所有帶有同樣Barcodes的序列，都來自于同一油滴（即同一個最初的10KB片段）。由此可見，10X Genomics本質也主要是對大量細胞的單細胞測序建庫準備。平臺本身無法直接對細胞的表型進行篩選，主要還是依賴于Cell Sorter平臺。

以上這些基于微流控的液滴技術成本低、消耗樣品及試劑量少，適合于需要將單細胞和其他所有參與的試劑提前獨立包裹在微滴中進行單細胞分離及分析，并不適合特定單細胞的長時間實時觀察分析相關的研究。

傳統的微反應室技術像Fluidigm公司的C1系統是在快速自動分理處單細胞并分配到微流體芯片上的單個制備倉中，跟10X相似的是C1主要還是應用在單細胞測序的建庫處理流程中，這里就不詳細介紹了。

美國Berkeley Lights（BLI）的納米光導流體平臺Optofluidic Platform是結合微流控的納升級微反應器技術 (Nano-Pen) 、光電定位技術（OEP）以及計算機系統的一體化完成單細胞分選、分析、培養以及導出功能的多功能單細胞平臺。在BLI平臺承載微流控體系的是其核心OptoSelect芯片。該芯片是一個精細的、集約化的、細胞運輸和培養功能兼而有之的流體管路系統，由納升級培養小室Nano-Pen和微流管道構成。微流系統可實現單細胞的運輸，而通過加以特殊外力即可實現向Nano-Pen中分選入單細胞；這種特殊外力作用便是OEP技術。