單細胞測序——“刻畫”肝癌免疫微環境的動態特征

　　肝細胞癌是世界范圍內死亡率排名第三的癌癥，其中中國的肝癌發病率居世界之首【1】。HBV的慢性感染是中國肝細胞癌發生的主要原因，其感染導致腫瘤微環境常伴隨慢性炎癥。免疫逃逸被認為是癌癥發展的標志之一，目前研究表明，腫瘤存在多種免疫逃逸機制，提出了研究腫瘤微環境中不同免疫細胞狀態的重要性【2】。而單細胞測序技術則是研究不同類型免疫細胞的狀態和動態的有力手段。

　　2019年10月31日，北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）張澤民教授、任仙文副教授聯合首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院彭吉潤教授以及勃林格殷格翰公司劉康博士，在Cell上發表了題為Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma的研究論文，結合10x Genomics和SMART-seq2兩種單細胞RNA測序技術，對肝癌患者多個組織的免疫細胞做出了系統性的刻畫，分析了免疫細胞動態遷移和狀態轉化的特征，探索了它們在肝癌治療上的潛在價值。

　　目前單細胞測序技術已經成為探究細胞類群多樣性的常用技術手段，而不同的測序技術在細胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優勢【3】。例如，目前常用的10x Genomics測序技術利用基于微滴包被的原理，可實現一次實驗獲得較多的細胞數量，有效降低了單細胞測序的實驗成本；而SMART-seq2測序技術則利用孔板對單個細胞進行實驗，通量相對較低，但每個細胞的基因捕獲率相對較高。因此，本研究結合了SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’兩種單細胞測序技術，并整合這兩種平臺的數據進行生物信息學分析，充分發揮不同數據類型的優勢，獲得高分辨率的肝癌免疫圖譜。

　　癌旁組織和外周血是腫瘤相關研究中常用的對照組織，而其他相關的免疫器官或病理組織則較少受到關注。例如，腹水是肝癌患者常見的病理現象，其產生與肝癌預后不良有關，然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌組織、癌旁組織、淋巴結、外周血和腹水五種組織的CD45+免疫細胞進行實驗，并分析肝癌免疫微環境中的細胞類型、表達特征，以及不同組織之間細胞的動態變化與聯系。

圖1 課題總體設計

　　 主要發現

　　1. 不同組織的免疫組成有較大差異，腫瘤中的巨噬細胞構成腹水中髓系細胞的主要來源

　　整合兩種單細胞測序數據，研究人員刻畫了高分辨率的肝癌免疫圖譜，包括T細胞、B細胞、NK細胞和髓系細胞等主要細胞類群以及主要類群下屬的40類細胞亞群。這些細胞亞群在不同組織中呈現出不同的細胞類型富集特征，其中腹水中的細胞類型呈現明顯的特異性。

　　為探究腹水中細胞的潛在起源，研究者將腹水中的免疫細胞與其他組織中的細胞進行基因表達比對，發現腹水中的淋巴細胞和髓系細胞來源明顯不同，淋巴細胞與外周血細胞有明顯的相似性，而髓系細胞主要定位于腫瘤組織細胞。隨后，通過前沿的生物信息學分析方法RNA velocity【4】和基于線粒體突變的進化樹構建【5】，研究者對巨噬細胞從腫瘤到腹水的遷移過程進行了確認。

　　2. 腫瘤中的巨噬細胞呈現兩種不同的狀態(TAM-like和MDSC-like)

　　通過與其他數據中的巨噬細胞進行轉錄組對應，研究者發現肝癌腫瘤中的巨噬細胞呈現兩種不同的狀態：TAM-like和MDSC-like狀態。生存分析表明，前者的特征基因與預后不良有關，其表達的兩個關鍵基因SLC40A1和GPNMB也與預后不良有關。通過CRISPR技術在THP-1誘導的巨噬細胞系中進行基因敲除和功能驗證實驗，研究者發現這兩個基因在細胞炎癥反應中起重要作用。

　　3. 腫瘤中的LAMP3+ DC是成熟態的DC，具有向肝淋巴結遷移和與多種淋巴細胞相互作用的潛在能力

　　腫瘤微環境中的樹突狀細胞，傳統上分為cDC1和cDC2，而本研究鑒定出一群特點突出的DC，即LAMP3+ DC。這群DC與cDC1和cDC2在表達特征上有較大的差別，主要表達CD80, CD83, CCR7等與成熟和細胞遷移有關的基因。而且這一類樹突狀細胞不僅存在于肝癌中，也存在于乳腺癌【6】和肺癌【7】中。隨后，研究者通過體外實驗證實了LAMP3+ DC是成熟態的DC，且具有較高的遷移能力。通過前沿的生物信息學分析方法RNA velocity【4】和基于線粒體突變的進化樹構建【5】，研究者發現LAMP3+ DC可能同時起源于cDC1和cDC2，且具有向肝淋巴結遷移的潛在能力。

圖2 左圖：將肝癌組織中樹突狀細胞的RNA velocity的計算結果投射到在Diffusion Map坐標上，顏色代表不同的細胞群。右圖：基于線粒體基因突變構建的LAMP3+ DC進化樹

　　腫瘤浸潤性的LAMP3+ DC發揮了廣泛調節淋巴細胞的作用，它們與T細胞和NK細胞上表達的配體-受體相互作用數量最多。LAMP3+ DC通過CCL19-CCR7和CCL22-CCR4吸引T細胞，并通過CD86-CD28作用于調節T細胞亞群，通過CD86-CTLA4作用于耗竭性T細胞亞群。研究者通過多色免疫組化對表達PD-1的T細胞與表達PD-L1的LAMP3+ DC進行了空間位置的判斷，發現其出現出相鄰的位置，為其相互作用提供了另一角度的證據。然而，LAMP3+ DC在腫瘤中的作用與功能仍需要進一步的研究和驗證。

　　本項研究首次對肝癌臨床樣本進行包括病理組織在內的多組織位點的收集，并利用前沿的生物信息學分析方法，通過自體對照，不僅描述了肝癌微環境的免疫組分和狀態，而且描繪了腫瘤浸潤免疫細胞跨組織的動態過程。

　　該可為人們研究肝癌和其他疾病中的免疫細胞，以及開發新的臨床檢測與治療方案提供新的思路。例如，研究揭示了腫瘤中的巨噬細胞構成腹水中髓系細胞的主要來源。由于外周血的免疫特征與腫瘤中具有較大差異，而組織活檢的取樣難度相對較大，該結果為利用肝癌病人的腹水代替外周血或活檢組織進行腫瘤狀態檢測提供了新的思路。針對巨噬細胞中與較差預后相關的基因GPNMB和SLC40A1，研究者通過揭示其在巨噬細胞中的炎癥作用，為相關藥物治療提供了潛在靶點。而研究發現的LAMP3+樹突狀細胞，可從腫瘤遷移到周淋巴結，表達多種免疫配體基因，并具有與多種T淋巴細胞類型相互作用的潛力。這為后續進一步對該細胞類型進行研究和應用提供了基礎，提出了通過調節免疫微環境進行腫瘤治療的可能性，并為基于樹突狀細胞的細胞療法提供了新的思路和依據。

　　為便利研究人員對相關領域進行深入探究，本研究中的肝癌單細胞數據已上傳至交互式網站，可通過http://cancer-pku.cn:3838/HCC/ 進行查看。

　　據悉，北京大學BIOPIC和生命科學學院博士生張啟明、北京大學前沿交叉學院博士生何堯和北京大學第九臨床醫學院（北京世紀壇醫院）博士生羅楠為該論文的并列第一作者，北京大學BIOPIC和生命科學學院張澤民教授、任仙文副研究員、北京世紀壇醫院彭吉潤教授和勃林格殷格翰公司研究人員劉康博士為該論文的共同通訊作者。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.003

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