原代細胞培養時離心的轉速一般多少

一、實驗前準備工作：

1、培養瓶的包被：包被液如多聚賴氨酸（PLL，ScienCell品牌，貨號0403或0413）或纖維粘連蛋白（BPF，ScienCell品牌，貨號8248），以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養瓶。37度孵箱1小時或4度過夜，從包被好的培養瓶中回收多聚賴氨酸，并用無菌水洗滌培養瓶2遍。包被好的培養瓶不要放置超過24小時，其中的包被液可吸出重復使用2-3次，注意不要污染。

2、完全培養基的配置：以內皮細胞培養基（ECM，ScienCell品牌，貨號1001）為例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌，貨號0025）、生長因子（ECGS，ScienCell品牌，貨號1052）和雙抗（P/S，ScienCell品牌，貨號0503）加入基礎培養液（ECM，ScienCell品牌，貨號1001）中。重新貼好標簽，并混勻培養基。

二、原代細胞復蘇方法：
1、從液氮中取出原代細胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間可以輕輕轉動細胞，加快融化速度，大約需要1分鐘時間。
2、5分鐘內用培養基稀釋至原體積的10倍以上，加入培養瓶中，再用1ml培養基洗滌細胞凍存管，保證細胞都被加入培養瓶中，靜置于孵箱，12-16小時后更換培養基（除去DMSO）。以后每2天換一次液，保證細胞狀態良好。

三、原代細胞傳代方法：酶消化法
當細胞生長至70-80%左右可以傳代，傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下：
1、棄去培養瓶中培養基，用PBS洗滌培養瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，貨號0103），以消化液能覆蓋整個瓶底為準。37度孵育4分鐘左右，輕拍培養瓶側面，顯微鏡下觀察細胞消化情況，直到80%細胞呈現圓形。
2、細胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，貨號0113），并輕輕搖動培養瓶，形成細胞懸液，然后將細胞和培養基轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。

3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培養基重新懸浮細胞并吹打均勻，接種于包被好的新培養瓶中，瓶中已有10ml左右的培養基，放入培養箱中培養，每2天更換培養基。