原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（三）

（1）DAN斑點雜交

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上。每個樣品一般點50μl（2～10μg DNA）。

④將膜烘干，密封保存備用。

（2）RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化）。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加 15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛）使RNA變性。然后取5～8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。

培養細胞，標本處理技術可以簡化，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理，離心去掉細胞核和細胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5×104）或組織。

整個RNA實驗中，要防止激活內源性RNase，有許多種預防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC）。

（3）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測。將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養細胞中檢測到少至5pg 的Epstein – Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它是使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P 標記的探針雜交。但它不適于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。

3．Southern印跡雜交（southern blot ）　　Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1）瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb）分離開。分離大分子DNA片段（800～12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%）,300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠，根據分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規格的電泳槽。

電泳時，同時將標記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。