二、快速原位雜交細胞化學技術
原位雜交免疫細胞化學技術存在的難點之一是實驗手續繁瑣，實驗周期長。國外Liesi等（1986）和國內學者何彬等應用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin）膠體金系統進行原位雜交，得到了快速滿意的結果，全部實驗可在數小時內完成。
作用把含某種多肽或蛋白的cDNA片段的質粒，按照第十九章 在光照下標記光敏生物素，然后經DNA酶消化1h，得到大量100～500bp長度的混合片段，變性后用于原位雜交。
如為培養細胞或細胞涂片，用95%乙醇、5%乙醇固定5min，PBS沖去固定液，加含探針的雜交液覆蓋（光敏生物素標記探針濃度為2.5ng/μl），在溫盒中50℃孵育1～2h，取出后直接加入膠體金標記鏈親合素（1mg/ml）室溫孵育15min，然后在室溫或37℃下用大容量（200ml/每片）洗脫液（2×SSC，0.1%Triton X-100）分別沖洗5～10min，以銀顯影液放大金顆粒顯示原位雜交結果，可用1%伊紅復染，脫水，透明，封片，鏡檢。
如為冰凍切片（cryostat section 10～15μm），應經新鮮配制4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS沖去固定液，吸干后滴加蛋白酶K（25μg/ml,Sigma）37℃15min，再用4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖去多聚甲醛，晾干后按上述方法進行原位雜交和雜交后沖洗。
三、原位啟動標記法
原位啟動標記法（Primed in situ labelling,PRINS），又叫寡核苷酸啟動法（Oligonucleotide－priming method）是Koch（1987）首先提出的，其基本原理是將未標記的寡核苷酸探針與細胞或組織中的靶DNA或RNA進行雜交，然后該寡核苷酸探針充當引物的作用，在Kelow多聚合酶的催化作用下，將生物素（或地高辛、熒光素）標記的核苷酸編入，以達到原位顯示的目的。PRINS技術具有3個方面的優點：首先由于探針在雜交時是未標記的，僅在雜交之后才進行標記，因此背景染色很低。至少，從理論上講，背景染色幾乎是零。其次是有效地縮短了實驗的時間，由于探針未經標記，無增加背景染色的顧慮。因此，可增加探針嘗試，縮短反應時間。雜交反應時間只需1h。實驗反應時間的縮短可有效的保持細胞或組織結構的完整性。第三個優點是能提高或增加信號的強度。Koch等曾成功的將此方法應用于染色體制片、單層細胞涂片和組織切片。它們還將此法與流式細胞計相結合以達到檢測群體離散細胞的目的。
在染色體或單層細胞涂片，載片在70℃的溶液中變性（70%甲酰胺，2×SSC）2min，立即在系統酒精中脫水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V），用吹風機吹干。預孵育在37℃～53℃20～30min，孵育時間加蓋玻片，孵育液含2～4pmol寡核苷酸探針，dATP，dCTP，dGTP各10mmol,5mmol生物素-11-dUTP在25μl×NT緩沖液中（1×NT緩沖液含50mmol/l Tris –HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO4,100μM二硫蘇糖醇（dithio threitol）,50μg/ml牛血清白蛋白），在預孵育時加入1μl的Klenow多聚酶。應用100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl在65℃洗1min 以終止反應，然后放入100ml×BN緩沖液（100mmol/l NaHCO3,Ph8.0,0.01% Nanidet P-40）40℃，進行檢測系統的顯示如熒光-親合素標記，過氧化物酶-親合素標記等。
總之，自Gall 和Pardue 1969年建立雜交免疫細胞化學以來的20余年中，已有不少新的改良的方法出現，但基本原則仍為Gall和Pardue所建立的相仿。作者個人體會是任何方法需在本人的實驗實踐中加以體驗和改良。比如目前對乙酰基化作用，即浸入醋酸酐和三乙醇胺是否能減低背景染色的問題有作者對此提出異議。在科技工作者認為在原位雜交實驗的所有應用溶液中加入0.1%～0.2%的二乙基焦碳酸乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）能有效的減低背景染色，但有些作者對此持懷疑態度。蛋白酶K的消化作用曾被認為是增加細胞或組織滲透性的關鍵步驟，但有作用在自身的實驗室實踐中體會除結構較致密的組織如腦、脊髓等外，對培養或涂片的單層細胞、蛋白酶K的消化及預雜交均是可以省略的。本文列舉各作者的操作步驟略有不同，可能是基于這個原因。
目前，原位雜交技術主要應用于基因組圖（Gene mapping），基因表達定位（localization of gene expression），核DNA和RNA的排列，mRNA的排列和運輸（arrangement and transport of mRNA），復制（replication）和細胞的分類（sorting of cells）。臨床研究應用在細胞遺傳學（Cytogenetics），生前診斷（Prenatal diagnosis），腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學劑量測定（biological dosimetry）和病毒學的病原學診斷等。隨著核酸探針的制備，標記方法和基本操作方法的不斷改進，新的技術不斷涌現，相信在不久的將來，原位雜交化學技術將會更廣泛的被應用于各個學科，并不斷為生命科學提供新的資料，開拓新的領域。
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