原核表達操作流程

實驗概要

本實驗介紹了原核表達的具體操作流程，包括：外源基因的誘導表達，大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化。

實驗原理

1. E. coli 表達系統
E. coli 是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E. coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質，將表達樣品進行SDS-PAGE 以檢測表達蛋白質。
2. 外源基因的誘導表達
提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導和藥物誘導。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導外源基因表達。
不同的表達質粒表達方法并不完全相同，因啟動子不同，誘導表達要根據具體情況而定。

主要試劑

1. 誘導表達材料
   1) LB （Luria—Bertani）)培養基
   酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
   NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
   蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
   適用范圍：大腸桿菌
   2) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃保存。
   3) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：
   50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
   50 mmol / L DTT
   2 % SDS （電泳級）
   0.1 ％溴酚藍
   10 ％甘油
2. 大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料
   1) 酶溶法
      a. 裂解緩沖液：
      50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
      1 mmol / L EDTA
      100 mmol / LNaCl
      b. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
      c. 10 mg / mL 溶菌酶。
      d. 脫氧膽酸。
      e. 1 mg / mL DNase I。
   2) 超聲破碎法
      a. TE 緩沖液。
      b. 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：
      100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
      100 mmol / L DTT
      4 %SDS
      0.2 ％溴酚藍
      20 ％甘油

主要設備

1. 超凈工作臺
2. 超聲破碎儀
3. 電泳設備
4. 移液槍
5. 培養皿等

實驗步驟

1. 外源基因的誘導表達
   1) 用適當的限制性內切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
   2) 按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到相應的宿主菌。
   3) 篩選出含重組子的轉化菌落，提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，
確定無誤后進行下一步。
   4) 如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32℃培養數小時，使培養液的OD₆₀₀達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42℃繼續培養3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37℃培養細菌數小時達到對數生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。
   5) 取上述培養液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。
2. 大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化
   1) 細菌的裂解
常用方法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法；酶溶法；化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法高溫珠磨法、高壓勻漿已在工業生產中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。

      a. 酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為：
         ① 4℃，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導表達的細菌培養液（100 mL ）。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液，懸浮沉淀。

         ②每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進行）。
         ③ 37℃，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時加每克菌20μL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。
      b. 超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎，在處理少量樣品時操作簡便，液體量損失較少，同時還可對染色體DNA 進行剪切，大大降低液體的粘稠度。
         ①收集1 L 誘導表達的工程菌，40 ℃，5000r pm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mLTE 緩沖液。
         ②按超聲處理儀廠家提供的功能參數進行破菌；10 000g 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。
         ③分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進行SDS -PAGE 。
注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關，應根據具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經3 -4 次凍溶后更容易破碎。
   2) 包涵體的分離
蛋白質在細菌中的高水平表達，常形成相差顯微鏡下可見到的細胞質顆粒，即為包涵體，經離心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白，須將洗滌過的包涵體重新溶解并進行重折疊。
      a. 試劑與配制
         ①洗滌液I：
         0.5 % Triton X -100
         10 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )
      溶于細胞裂解液中。
         ② 2×凝膠電泳加樣緩沖液。
       b. 細胞裂解混合物12 000g 離心，15 min , 4℃；棄上清，沉淀用9× 洗滌液l 懸浮；室溫放置5 min ; 12 000g  離心15 min , 4℃；吸出上清，用100 μL 水重新懸浮沉淀；分別取10 μL上清和重新懸浮的沉淀，加10 μL 2×  凝膠電泳加樣緩沖液，進行SDS-PAGE 。
   3) 包涵體的溶解和復性
      a. 試劑與配制
         ①緩沖液I：
         1 mmol / L PMSF
         8mol /L 尿素
         10 mmol / L DTT
      溶于前述裂解緩沖液中。
         ②緩沖液Ⅱ：
         50 mmol / L KH₂PO₄
         1 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )
         50 mmol / L NaCI
         2 mmol / L 還原型谷胱甘肽
          1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽
         ③ KOH 和HCI 。
         ④ 2×凝膠電泳加樣緩沖液。
       b. 用100 μL 緩沖液I 溶解包涵體；室溫放置lh ；加9×緩沖液Ⅱ，室溫放置30 min ，用KOH 調pH 到10.7 ；用HCI  調至pH 8 . 0 ，在室溫放置至少30 min; 1000g 離心，15 min ，室溫；吸出上清液并保留，用100 μL  2×凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀；取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液，與20 μL 重新溶解的沉淀進行SDS-PAGE 。

注意事項

1. 不同的大腸桿菌表達載體帶有不同的啟動子和誘導成分。實驗者必須根據特定系統和用途決定相應的實驗方案。
2. 表達和檢測時，應設置對照組，如轉化載體和非誘導細胞。
3. 由于大腸桿菌中表達的重組蛋白質缺少哺乳動物細胞特異的翻譯后加工，所以，其生物活性無法與天然蛋白質相提并論。