雙向電泳實驗——ISODALT方法

蛋白質樣品

尿素去污劑

聚丙烯酰胺凝膠

一、第一向

1. 等電聚焦凝膠的準備

雙向電泳通常用聚丙烯酰胺凝膠作介質，但需含有 8 mol/L 尿素、0.5%~2% 非離子或兩性離子去污劑。為了增加樣品的可溶性，可加 0.5% CHAPS。在第一向電泳中，最重要的是用載體兩性電解質建立 pH 梯度。如 載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦 所述混合不同 pH 范圍的載體兩性電解質或使用預混合的載體兩性電解質可以增加第一向電泳的分辨率。

O'Farrell 的 ISO-DALT 系統的第一向是用管狀凝膠，雖然也能得到高分辨，且上樣量大，對鹽的耐受量也大，但會由于電內滲效應丟失堿性蛋白。平板等電聚焦時電極只與凝膠的邊緣接觸，電解體積小，陰極漂移小。相對來說不易丟失蛋白。將薄層凝膠聚合在支持膜上更能得到好的結果。

含有尿素、離子去污劑和載體兩性電解質的凝膠聚合方法請參閱 載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦。

2. 樣品準備和加樣

可溶蛋白的樣品，如體液，細胞和組織的萃取液能直接用于雙向電泳，但應稀釋到合適的濃度。固體樣品，如組織，細胞或在組織培養液中的細胞，加樣前應先破碎，研磨和溶解。通常使用的溶解液是 O'Farrell 提出的 9 mol/L 尿素和 2% ( W/V）非離子去污劑（NP-40 或 Triton X-100 )。但對有些蛋白，如組蛋白、核糖體蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困難的，必須做適當處理。

使用管狀凝膠和垂直平板凝膠時，樣品被加在濃縮膠的頂上，靠近電極容易引起蛋白的變化，水平電泳可加在凝膠的合適位置。有關樣品的溶解、加樣方法、加樣量等請參閱 載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦。

3. 等電聚焦

等電聚焦的方法同 載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦。由于雙向電泳用的第一向凝膠和樣品中含有尿素和去污劑，聚焦時的溫度應稍高于通常用的溫度，如 15~20℃，以防止尿素結晶。如在凝膠上覆蓋一層膜，也可以防止尿素結晶，并克服大氣中二氧化碳的影響。由于尿素使蛋白變性，會增加蛋白分子的直徑。鑒于以上一些原因， 應使用新鮮樣品和凝膠，并適當降低電壓和增加聚焦時間。

4. pH 梯度的測定

如采用表面電極進行測量，由于尿素和溫度對 pH 的影響，應使用校正因子，請參閱 載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦 的有關章節。

另一種方法是用蛋白標準作為內標準。常用的等電點蛋白標準不能用于雙向分析，因為電泳條件不同。雙向電泳的標準是選擇一些合適的蛋白，在有尿素時加熱不同時間得到的，最終在雙向凝膠上呈現以一定 pH 單位間隔排列的點，點的數目取決于蛋白質氨基酸的組成。

5. 平衡

第二向 SDS 電泳前，將等電聚焦凝膠按樣品泳道剪成膠條，用含有 SDS，在還原條件下的 pH 8.8 Tris 緩沖液平衡。目的是使蛋白質分子與 SDS 和還原試劑充分相互作用，解聚蛋白質分子，并與 SDS 結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 膠束，以確保第二向的遷移。平衡時間是很重要的因素。柱狀膠約需 30~40 分鐘，薄層膠（0.5~1 mm ) 約需 5~10 分鐘，超薄膠只需 1~2 分鐘。

二、第二向

1. SDS 凝膠的準備

請參閱 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳 各種不連續 SDS 凝膠灌注方法。

2. 二向間的轉移

平衡后的等電聚焦凝膠條與 SDS 凝膠的良好接觸是雙向電泳結果的保證。管狀凝膠的轉移需要用瓊脂糖密封，但瓊脂糖中的不純物在銀染時會顯現斑點。如用快速丙烯酰胺聚合的方法，聚合過程中產生的熱會使蛋白變性。

垂直平板電泳時凝膠間的轉移可以直接放置，但要防止膠條被拉長，否則蛋白帶會歪斜而使雙向電泳譜畸變。薄層水平電泳間的轉移比較容易，因為凝膠聚合在支持膜上，只要將等電聚焦凝膠的膠面向下，貼于 SDS 凝膠上，避免氣泡陷入即可。為了以后分子質量的測定，在 SDS 凝膠的一端應加分子質量蛋白標準。

3. SDS 電泳

請參閱 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳 SDS 電泳的方法。

4. 檢測

考馬斯亮藍染色、銀染色、熒光標記、放射自顯影等檢測方法請參閱 常規聚丙烯酰胺凝膠電泳 和 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳。由于雙向電泳的高分辨率，分離的蛋白斑點無法用肉眼來比較和辨別，應該用凝膠掃描或攝錄系統將數據進行處理。

在離心前，樣品在SDS/溶解緩沖液中煮沸5 min，千萬不要在尿素/溶解緩沖液中加熱樣品。在第1向電泳前離心樣品。

常見問題：

1.重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？

一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。

2.為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？

通常情況下，等點聚焦中體系內除了蛋白質還會存在少量帶電小分子，當這些帶電小分子在電場中向兩極運動時，會帶動膠條中的水分子運動，水分子運動會帶動附近的覆蓋油移動，當樣品質量不高，帶電小分子較多時，會導致覆蓋油移動嚴重溢出膠條槽，此時，通常會伴隨膠條的酸性端膠條厚度增加。當發生覆蓋油溢出或膠條暴露時，應及時補加覆蓋油。為了防止這個現象的發生，應從樣品制備時嚴格控制樣品質量，盡量減少帶電小分子如鹽離子的含量。同時可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（80 %滿）的覆蓋油。

3.跑第一向時，為什么要設定一個電流的最大值電壓（50 μ A/ 膠）？

電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，修飾蛋白，從而對等電聚焦產生影響。

4.跑第一向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？

剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由于這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區域移動，而蛋白質運動需要較高的電壓。

5.跑第一向時，為什么會產生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？

藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區時（pH4），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質大分子聚焦之前。

6.跑第一向時，為什么電壓總達不到預定值？

當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。

跑第一向時，在電壓達到預定值后，電流為什么會降低？

當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。

7.跑第一向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產生？

等電聚焦完成后，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域，而成為中性分子。這時加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。

8.重泡脹緩沖液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？

硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。

9.怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？

可以根據膠條的pH范圍和長度估算蛋白質點的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白質點分子量。也可以用體系內已知蛋白來做比對。

10.為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？

橫的脫尾可能是：1）一向等電聚焦不完全； 2）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的豐度太高。豎的脫尾可能是1）平衡時碘乙酰胺量不足；2）跑二向時，蛋白的溶解度不好。

11.什么成分會影響 2D 膠的效果？

核酸，鹽，去垢劑等等。

12.2D 膠的上樣量應該在什么范圍？

上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。

13.我的蛋白質濃度很低，應該用什么方法來濃縮？

蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較干凈的環境（不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。