| 實驗方法原理 | SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是對蛋白質進行量化，比較及特性鑒定的一種經濟、快速、而且可重復的方法。該法主要依據蛋白質的分子量對其進行分離。SDS 與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊結構，并使其穩定地存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS 蛋白質復合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDS-PAGE 因易于操作和廣泛的用途，使它成為許多研究領域中一種重要的分析技術。 我們對 SDS-PAGE 的介紹包括線性薄膠的操作步驟，這種膠是指在兩層支持的玻璃板之間形成的薄片狀凝膠。由于薄片膠可在同一塊膠上跑很多樣品，使聚合、染色、脫色具有一致性，所以薄片膠比管狀膠應用的更為廣泛。對于分析性的應用，既可以減少電泳所需的時間和原材料，也可以提高分辨率，所以小的薄片膠更受入青睞。本章所介紹的實驗步驟及試劑均是根據 Bio-Rad 的小凝膠系統來計算的。但這些步驟也適用于其他系統。另外，有些情況下需要使用梯度膠。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | 微型凝膠電泳裝置100℃ 沸水浴Eppendorf 管微量注射器（50 ul 或 100 ul）干膠器真空泵或水泵帶蓋的玻璃或塑料小容器搖床 |
| 實驗步驟 | 1. 儲存液的配置 （1）2 M Tris-HCl（PH 8.8），100ml 稱取 24.2g Tris 堿；加 50ml 蒸餾水； 緩慢的加濃鹽酸至 pH 8.8（約加 4 ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH 將會升高； 加蒸餾水至 100 ml。 （2）1 M Tris-HCl（PH 6.8），100ml 稱取 12.1g Tris堿； 加 50ml 蒸餾水； 緩慢的加濃鹽酸至 pH 6.8（約加 8 ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH 將會升高； 加蒸餾水至 100 ml。 （3）10％（w／v）SDS，100 ml。室溫保存 稱取 10 g 的 SDS； 加蒸餾水至總量為 100 ml。 （4）50％（v／V）甘油，100ml 到取 50 ml 100％ 的甘油； 加入 50 ml 蒸餾水。 （5）1％（w／v）溴酚藍，10ml 稱取 100 mg 溴酚藍； 加蒸餾水至 10 ml，攪拌直到完全溶解； 過濾除去聚合的染料。 2. 工作液的配置 （1）A液：丙烯酰胺儲存液，100 ml 30％（w／v）丙烯酰胺，0.8％（w／v）雙丙烯酰胺， 29.2 g 丙烯酰胺 0.8 g 雙丙烯酰胺
3. 灌制分離膠 （1）組裝凝膠模具叫按照使用說明書，裝配好灌膠用的模具。 對于 Bio－Rad 的微型凝膠電泳系統，在上緊螺絲之前，必須確保凝膠玻璃板和隔片的底部與一個平滑的表面緊密接觸（見圖 1），釘細微的不匹配就會導致凝膠的滲漏。
（2）將 A 液、B 液及蒸餾水在一個小燒瓶或試管中混合，丙烯酰胺（A 液中）是神經毒素，操作時必須戴手套。 （3）加入過硫酸銨和 TEMKD 后，輕輕攪拌使其混勻（過量氣泡的產生會干擾聚合）。凝膠很快會聚合，操作要迅速。 （4）小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內（見圖 2），這樣可以避免在凝膠內產生氣泡。
（5）當加入適量的分離膠溶液時（對于小凝膠，凝膠液加至約距的玻璃板頂端 1.5 cm 或距梳子齒約 0.5 cm，見圖 3）。輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層 1～5 mm 的水層，這使凝膠表面變得平整。
（6）等待 30～60 min，使凝膠聚合。當凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現一個清晰的界面，可以微微傾斜模具，檢測凝膠是否聚合。另外的辦法是將灌完分離膠后剩余的凝膠溶液置于一個小容器內，作為檢測凝膠聚合的標志。如果凝膠滲漏，但還沒有覆蓋水層。可以回收分離膠溶液，重新裝配玻璃板和隔片，在凝膠聚合之前重新灌膠。分離膠可在 4℃ 儲存一周。 4. 灌制堆積膠 （1） 吸盡覆蓋在分離膠上的水； （2） 將 A 液、C 液和蒸餾水在三角燒瓶或小試管中混合； （3） 加入過硫酸銨和 TEMED，并輕輕攪拌使其混勻； （4） 將堆積膠溶液用吸管加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端（見圖 4）；
（5） 將梳子插入凝膠內，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊（見圖 5 和圖 6）。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產生；
（6） 約 30 min 凝膠聚合； （7） 凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂； （8） 將凝膠放入電泳槽內，如果使用 Bio-Rad 的微型凝膠系統，可預先接好電極； （9） 將電泳緩沖液加入內外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。 5. 制備樣品和上樣 （1）每孔的上樣量（Bio-Rad 的微型凝膠系統） （2） 將蛋白質樣品與 5× 樣品緩沖液（20 ul＋5 ul） 在一個 Eppendorf 管中混合； （3） 100 ℃ 加熱 2～10 min； （4） 離心 1 s，如果有大量蛋白質碎片則應延長離心時間； （5） 用微量注射器將樣品加入樣品孔中。將蛋白質樣品加至樣品孔的底部。 并隨著染料水平的升高而升高注射器針頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。 6. 電泳 （1） 將電極插頭與適當的電極相接。電流應流向陽極； （2） 將電壓調至 200 V（保持恒壓；對于兩塊 0.75 mm 的膠來說，電流開始時為 100 mA， 在電泳結束時應為 60 mA； 對于兩塊 1.5 mm 的膠來說，開始時應為 110 mA， 結束時應為 80 mA。）； （3） 對于兩塊 0.75 mm 的凝膠，染料的前沿遷移至凝膠的底部約需 30～40 min（1.5 mm 的凝膠則需 40～50 min）； （4） 關閉電源； （5） 從電極上拔掉電極插頭； （6） 從電泳槽中取出凝膠玻璃板； （7） 小心移動兩玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上。 7. 考馬斯亮藍染色 （1）戴上手套避免將手指印留在電泳膠上，將膠移入一個小的盛有少量考考馬斯亮藍（20 ml 已經足夠）的容器內（小心不要將膠撕破）、或將玻璃板連同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落； （2）對于 0.75 mm 的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩 5～10 min，對于 1.5 mm 的凝膠，則需 10～20 min， 在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口； （3） 棄去染液，將凝膠在水中漂洗數次。戴手套以避免將雙手染色； （4） 加入考馬斯亮藍脫色液（約 50 ml），清晰的條帶很快會顯現出來，大部分凝膠脫色需要 1 h， 使用過的脫色液則可用水沖冼掉。為了脫色完全，需數次更換脫色液并震蕩過夜。 8. 銀染色 （1） 戴上手套，將凝膠移至一個盛有 50％ 中醛和 10％ 醋酸混合液的小容器內，至少浸泡換液 2～3 次； （2） 用清水漂洗 30 min， 期間至少換水 3 次； （3） 準備溶液 A，B、C； （4） 將凝膠移入一個干凈的容器內，在持續溫和振搖下用 C 液染色 15 min； （5） 用去離子水漂洗凝膠，在輕輕振搖下浸泡 2 min； （6） 準備溶液 D； （7） 將凝膠移至一個干凈的容器內，用溶液 D 洗滌，顯色。銀染的電泳帶一般在 10 min 內出現，則更換溶液 D。如果背景已開始變為淡黃色，則應該停止反成； （8） 將凝膠浸入 1％ 的醋酸終止反應； （9） 在蒸餾水中漂洗凝膠至少 1 h， 換水三次； （10） 如果蛋白質染色太深，則可用 Kodak Rapid Fix 或 Kodak Rapid Unfix 使電泳膠脫色再用 Kodak clearing agent（如 Orbit） 終止脫色，然后用 50 ％ 甲醉/10 ％ 的酷酸漂洗； （11） 將凝膠保存于水中或進行干膠。 9. 干膠 （1） 將凝膠置于一個干凈的表面上（玻璃板或潔凈的操作臺上）； （2） 用蒸餾水做潤滑劑，調整加樣孔間隔膠便其保持垂直； （3） 用一張 10 cm×12 cm 的 Whatman 3 MM 濾紙覆蓋凝膠，將濾紙連同凝膠從玻璃板或操作臺上揭下來，凝膠會粘在濾紙上； （4） 用一張玻璃紙或塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的表面，小心不要將氣泡裹進去，這樣會導致凝膠的破裂。可用一個試管作為卷軸拖運可以有效的除去氣泡； （5） 將 Whatman 濾紙與凝膠置于干膠器上，開啟加熱和抽真空開關，并蓋上帶有密封圈的蓋子。 |
| 注意事項 | 1. 丙烯酰胺：有劇毒，可導致中樞神經麻痹，也可能有致癌和致畸變作用。可被正常皮膚吸收。如果皮膚接觸了丙烯酰胺的粉末或溶液相，立即用肥皂水沖洗。未聚合的丙烯酰胺仵過量催化劑以固體廢物形式處理。 2. 過硫酸銨：可以用水稀釋后沖洗棄之。 3. TEMED： 用避光的瓶子在 4℃ 保存。有報道認為保存 10～12 個月后活性顯著下降。 4. 硝酸銀：有毒及皮膚刺激。混合的氫氧化銀銨溶液（溶液 C） 水分蒸干后形成烈性炸藥，因此用完后 Ag2＋應立即加鹽酸使其沉淀。 |
