| 實驗方法原理 | 收集細胞，用 D-PBSA 洗滌，重新制成 5×107個/ml 的細胞懸液，制備細胞抽提物并置于 -70°C 保存。準備凝膠裝置，取 1~2 μl的細胞抽提物、標準品及對照點樣于瓊脂糖凝膠。槽內充滿液體，將瓊脂糖凝膠置于其中，電泳 25 min，加入酶反應試劑，孵育 5~20 min 后，沖洗凝膠，干燥，檢査已完成的凝膠酶區帶的顯示。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 細胞 抽提物 酶底物 核苷酸磷酸化酶（NP) 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD) 蘋果酸脫氫酶（MD） 乳酸脫氫酶（LD) 天冬氨酸氨基轉移酶（AST) 6-磷酸甘露糖異構酶（MPI) 肽酶B(Pep B) |
| 試劑、試劑盒 | 細胞抽提緩沖液或Triton X-100抽提溶液 緩沖液SAB8.6 D-PBSA 蒸餾水 去離子水 |
| 儀器、耗材 | Authentikit裝置和試劑 瓊脂糖凝膠膜SAB8.6 孵育盤襯墊 孵育盤 染色或洗滌盤 溫度控制室的槽蓋和槽底 定時電泳儀 安全連接器 孵育室或干燥器 配有1英寸長磁力棒的磁力攪拌器 樣品加樣器Teflon 頭 凝膠記錄表 酶遷移數據表 細胞I.D.最終分析表 微升注射器 微量離心機 Eppendorf 管 加樣器 加樣器吸頭 移液管 100ml帶刻度的量筒 記號筆 防護手套 裝吸頭的垃圾桶 |
| 實驗步驟 | 一、抽提物的制備 1. 按常規方法培養細胞達 2×107 個活細胞。 2. 依照具體細胞系實驗推薦的方法收集細胞。 3. 細胞團重懸于 D-PBSA 中，計數活細胞。 4. 細胞懸液以 300 g 離心 5~10 min 沉淀細胞，傾去上清液。 5. 重復步驟 3 和 4 , 總共洗滌細胞 3 次。 6. 向細胞團塊中加人 100 μl 抽提液（細胞抽提緩沖液（Innovative Chemistry，Inc） 或 Triton X-100 抽提溶液：1:15（V / V），Triton X-100 溶于生理鹽水，包含 6.6×10-4 mol/L EDTA，pH 7.1（4℃保存））。 7. 小心地將細胞懸液吸取至小容量移液管中，上下吹吸直至全部細胞裂解。 8. 將細胞裂解液移至 Eppendorf 管（1.5 ml）中，用移液管上下吹吸數分鐘直至細胞膜成云霧狀并集結在一起，用微量離心機（microfuge） 以最高速度 （約 9000 g ) 離心細胞裂解液 2 min ，收集上清液，等分為所需體積，-70°C 保存。 二、安裝電泳裝置 1. 打開孵育箱電源。 2. 每個孵育盤內放一個盤墊。 3. 在每個孵育盤中加人 6.0 ml 去離子水，37°C 保溫 20 min。 4. 向電泳槽每個盤室中加入 95 ml SAB 8.6 緩沖液（整個電槽中緩沖液的總體積為 190 ml） 該緩沖液不可重復使用，因為電泳過程中 pH 值會有顯著改變。 5. 將裝了緩沖液的電泳槽通過安全連接線與電壓可調的電源連接，電源接地。 6. 將每個溫控電泳室蓋表面充滿 500 ml 冷水（4~10°C )。電泳蓋一定要在垂直放置時裝滿水，否則水將流失。用冰將水冷卻或在冰箱中貯備足夠的冷水，每次電泳前要更換冷水。 7. 在每種染色盤中加 500 ml 去離子水或蒸餾水，并用它洗滌孵育盤。這些水不能重復使用。 三、電泳步驟 1. 標記每塊待用瓊脂糖凝膠。可用 Innovative Chemistry，Inc 的標簽或用永久性記號筆在凝膠背面作個記號。 2. 將凝膠放在臺面上，塑料突起向下。調整凝膠方向使樣品孔離操作者最近。 3. 標記每個樣品孔，標明將被檢測的樣品，（如：標準、對照、未知 1、未知 2 等）每塊凝膠可檢測 6 個未知樣品。 4. 將瓊脂糖凝膠從堅硬的塑料支持物上小心地剝離。沿著邊緣小心處理凝膠，棄去硬塑料支持物。 5. 向樣品孔加入細胞抽提物。用裝有 Teflon 頭的分液器將 1 μl 細胞抽提物精確地加到每個孔中。每個樣品用一個新的頭。將分子量標準品點樣于泳道 1，對照點樣于泳道 2，未知點樣于泳道 3~8。為避免損傷瓊脂糖，只有細胞抽提液滴可接觸樣孔，點樣器尖不能碰孔。若點樣量為 2 μl，在第 1 μl 樣品散到瓊脂糖內后再點第 2 滴。 6. 將每個已點樣的瓊脂糖膠插入電泳槽蓋上，瓊脂糖面向外。將瓊脂糖膠的陽極（+ ) 與電泳槽蓋的陽極（+ ) 匹配，可能需將瓊脂糖凝膠輕微彎曲以便插入電泳槽蓋。 7. 在每個電泳槽座上放一個電泳槽蓋。內部有磁鐵的黑端最靠近電源。打開電源（160V），定時 25 min 。 8. 在電泳結朿前大約 5 min 時，從冰箱中拿出每種底物試劑瓶，使其恢復到室溫。 9. 臨用前加入 0.5~1 ml 去離子水至每個試劑瓶中，輕輕地旋轉小瓶使試劑溶解。 10. 電泳結束時，從電泳槽座上拿開電泳槽蓋并將其置于吸水紙上。 四、染色步驟 1. 從電泳槽室中取出瓊脂糖膠，抓住凝膠膜邊緣，向內輕壓便可將其從蓋中取出。 2. 將瓊脂糖凝膠側立，置于水平放在平面上的吸水紙上，點樣孔朝向操作者。 3. 仔細地用不起毛的吸紙吸去瓊脂糖膠兩端殘余的緩沖液。 4. 沿著瓊脂糖凝膠膜底邊放置一支 5 ml 的移液管。 5. 沿著移液管的前緣將重新制備的底物均勻傾倒于瓊脂糖膠上。 6. 用平滑的動作推動吸管經過瓊脂糖表面，一次完成，再向操作者方向拖回吸管，在瓊脂糖表面推多次，吸管滾動著離開瓊脂糖末端，在此過程中移去多余的物質，注意不要破壞瓊脂糖凝膠，此步無需加壓。 7. 將邊緣整齊的瓊脂糖膠放在預熱的孵育器盤中，瓊脂糖面向上，并把盤置于 37℃ 孵箱內 5~20 min 。 8. 孵育后，用 500 ml 雙蒸水或去離子水清洗瓊脂糖膠兩次，用磁力攪拌棒攪動，每次 15 min，第一個 15 min 后，取出每個凝膠膜，將水棄去，加入 500 ml 新鮮水于器皿中，將凝膠膜浸人水中，并予以遮蓋避光，確保凝膠膜完全浸入而不是在漂浮清洗液上。 9. 從水中取回凝膠膜，將其放置于孵箱或烤箱烘干室的烘干架內，烘干 30 min 或直到瓊脂糖膠干燥，也可將瓊脂糖膠室溫干燥過夜。 10. 清潔整理，倒掉電泳槽底緩沖液，并用蒸餾水沖洗，將電泳梢蓋中的水倒出，沖洗槽蓋內部，并晾干。 11. 結果評價，區帶是永久性的，凝膠膜也可保存起來，便于將來參考，如果隨時間延長，出現背景染色，說明凝膠清洗不夠充分。 |
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