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    發布時間:2020-07-07 16:11 原文鏈接: 哺乳動物原代細胞培養的β半乳糖苷酶(熒光測定)

    β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼,可催化半乳糖苷水解。

    最大優勢是易于用免疫組織化學法觀測其原位表達,是最常用的監測轉染率的報道基因之一。

    以鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)為底物可用標準的比色法檢測酶活性,其檢測動力學范圍為6個數量級。氯酚紅—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一個可用比色法檢測酶活性的底物,其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷(FDG)為底物則可用熒光法檢測其活性。

    此法可檢測單個細胞的酶活性,并可用于流式細胞學(FACS)分析。如以二氧雜環丁烷為底物,可用化學發光法檢測酶活性,其檢測動力學范圍最大,靈敏度最高,與用生物發光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。

    試劑和器材: 
    1. 反應緩沖液:100mmol/L醋酸鈉,100mmol/L KCl、2%(體積分數)Triton X-100、5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT),pH4.3;
    2. 底物:1.7mmol/L4-甲基-傘形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)或鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG),溶于反應緩沖液中;
    3. 微量離心機;
    4. 熒光計:透射光波長355nm,激發光波長460nm,比色皿可容納200μl樣品;
    5. 流式細胞學(FACS)分析
    6. 37℃水浴鍋;

    實驗方法:
    哺乳動物原代細胞培養。
    原代細胞收集后。
    1. 用兩倍體積的緩沖液進行稀釋,然后于0—4℃下在微量離心機中離心10min以獲得具有梯度的沉淀物;
    2. 在0.25ml的反應緩沖液中重懸沉淀;
    3. 與等體積的底物進行混勻,37℃孵育1h。使用0.25ml的反應緩沖液代替底物來作為樣品空白;
    4. 再配有一份底物空白;
    5. 1h后測定熒光;
    6. 流式細胞學(FACS)分析


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