噬菌體的分離、純化及效價測定

一、目的要求
1、學習分離、純化噬菌體的基本原理和方法。
2、學習噬菌體效價測定的基本方法。

二、基本原理
因為噬菌體是專性寄生物，所以自然界中凡有細菌分布的地方，均可發現奇特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易的分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。由于噬菌體侵入細菌細胞后進行復制而導致細胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，（a）在液體培養基內可使混濁菌懸液變為澄清，此現象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養基，進行培養，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；（b）在宿主細菌生長的固體瓊脂  平板上，噬菌體可裂解細菌而形成透明的空斑，稱噬菌體斑（圖1），一個噬菌體產生一個噬菌斑，利用這一現象可將分離到的噬菌體進行純化與測定噬菌體的效價。
本實驗是從陰溝污水中分離大腸桿菌  噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現噬菌斑的形態、大小不一致等，然后再進一步純化。
噬菌體的效價就是1 毫升培養液中所含活噬菌體的數量。效價測定的方法，一般應用雙層瓊脂平板法。由于含有特異宿主細菌  的瓊脂平板上，一個噬菌體產生一個噬菌體斑，因此，能進行噬菌體的計數。

二、器材
37℃培養18 小時的大腸桿菌斜面，陰溝污水；
本實驗均用普通肉膏蛋白胨培養基500 毫升三角瓶內裝三倍濃縮的液體培養基100 毫升，試管液體培養基，瓊脂平板，上層瓊脂培養基（含瓊脂0.7%，試管分裝，沒管4 毫升），底層瓊脂平板（含培養基10 毫升，瓊脂2%）大腸桿菌 18 小時培養液，大腸桿菌噬菌體 10-2 稀釋液（用肉膏蛋白胨液體培養基稀釋）含 0.9 毫升液體培養基的小試管 4 支，肉膏蛋白胨瓊脂平板（ 10 毫升培養基， 2 ％瓊脂，作底層平板用），含 4 毫升瓊脂培養基的試管（ 0.7％瓊脂，作上層培養基用）5 管，滅菌小試管 5 支，滅菌 1 毫升吸管10 支，48 ℃ 水浴箱等。滅菌吸管，滅菌玻璃途布器，滅菌蔡氏細菌濾器，滅菌抽濾器，恒溫水浴箱，真空泵等。