土霉素具有廣譜抗病原微生物作用，為快速抑菌劑，高濃度時對某些細菌呈殺菌作用。其作用機制在于藥物能特異性地與核糖體30S亞基的A位置結合，阻止氨基酰-tRNA在該位置上的聯結，從而抑制肽鏈的增長和影響細菌或其他病原微生物的蛋白質合成。
土霉素對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、化膿性鏈球菌、淋球菌、腦膜炎球菌、大腸桿菌、產氣桿菌、志賀菌屬、耶爾森菌、單核細胞李斯特菌等有較強抗菌活性；此外，土霉素對立克次體、支原體、衣原體、放線菌等也有較強作用。
