5. 確定腫瘤細胞的來源
揭示腫瘤發生過程中的細胞來源將為開發與改善治療策略提供非常重要的理論基礎。應用GEM模型已經成功闡明了某些不同腫瘤類型的細胞起源。在小細胞肺癌（SCLC）研究中，通過氣管內注射細胞特異性的Adeno-Cre病毒載體，使Trp53和Rb1兩基因分別在Clara細胞, 神經內分泌的（NE）細胞，以及II型肺泡（SPC）細胞被特異性敲除，分析腫瘤發生的不同時間和腫瘤表型等。結果表明，相對于SPC細胞，NE細胞是造成SCLC形成的主要細胞來源。另外，細胞來源的研究也能提供與以前研究結果不一樣的意外結果。比如，過去以BRCA1為基礎的乳腺癌研究認為，該類癌癥的來源細胞是基底上皮干細胞。而在應用GEM模型對BRCA1引起的基底樣乳腺癌研究中發現，其實管腔祖細胞才是基底樣腫瘤的真正來源。
最近來自兩個不同實驗的研究結果表明，遺傳變異（如Pik3ca突變）可顯著地影響干細胞庫組成。Pik3ca點突變（如H047R）引起具有譜系特征的乳腺上皮細胞分化為多能干細胞樣狀態能力損失。而且，Pik3ca乳腺腫瘤的細胞來源主導了其惡性程度，表明了在改善抗癌癥藥物及治療效果的特異性方面，準確找到腫瘤細胞來源具有非常重要的實際意義。
6. 驗證新藥物靶點
考慮到不是所有的癌基因都是維持腫瘤形成所必須的，因此，在針對相應的靶點藥物，開展人體臨床試驗前，即在臨床前的動物體內，驗證滅活TSG，或者降低致癌基因是否能引起進行中腫瘤的萎縮成為非常重要的試驗。應用可誘導小鼠模型可實現對致癌基因維持腫瘤相關性的驗證，如在乳腺癌小鼠模型中，癌基因Pik3ca表達去誘導后，引起部分腫瘤的萎縮，提示這些腫瘤是與“依賴”廣泛性活性P13K信號密切相關的。然而，多數腫瘤最終因Met或Myc增加而復發，提示這些遺傳損傷可能會誘導對P13K抑制劑的耐受性。此例子說明可誘導GEM模型應用于臨床前研究，不僅可達到驗證藥物靶點的目的，而且對揭示藥物耐受性的形成機制也具有其實際意義。
TSG也有可能成為有效的藥物靶點。由于p53基因的顯性負作用或抑制突變，以及其特異性抑制劑MDM2和MDM4的增加/過表達等的原因，導致腫瘤中的p53功能喪失。應用可逆轉抑制p53活性的GEM模型遺傳學研究表明，重新恢復p53基因功能，可快速使已形成的腫瘤消退，提示研制抑制MDM2分子，從而恢復p53功能，或將突變型p53重新恢復為具有野生型功能p53的抗腫瘤藥物的臨床意義。同樣，應用可誘導敲低APC的GEM模型研究結直腸癌的結果也表明，誘導恢復APC功能后，可迅速引起快速與廣泛的腫瘤細胞分化和持續的無復發萎縮，這為體內評價APC/Wnt通路作為APC突變引起的結直腸癌的治療靶點提供了依據。
7. 闡明治療效應與耐受
為了將臨床試驗中抗腫瘤新療法失敗的風險盡量降低到最低，建立臨床前高效及預測性強的體內模型，客觀評估相應藥物效應及耐受性就顯得更加重要。通過Kras突變引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型的研究發現，GEM模型對靶向治療和傳統化療的應答效應與相應病人的應答性具有非常大的相似性。需要加以關注的是小鼠與人在藥物代謝方面表現明顯不同，比如，參與肝臟藥物代謝的細胞色素P450酶底物特異性方面，不同的物種存在較大的差異。該類問題可借助人源化小鼠模型加以解決。因此，建立人源化的GEM模型作為臨床前藥物效果的研究，將有助于優化針對靶特異抗腫瘤藥物的研發，以及尋找與確定治療效應的關鍵因素，并使其成為腫瘤病人特征的預測性生物標記。另外，GEM模型也可應用于探索治療敏感性腫瘤獲得性耐藥的形成機制。
在探討腫瘤治療效應與耐受機制方面，K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作為BRCA1突變乳腺癌臨床前GEM模型的一個非常有說服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模擬類人BRCA1突變乳腺癌組織病理學特征的乳腺腫瘤，而且，對含鉑類藥物和PARP抑制劑也具有高敏感性。臨床試驗證實，PARP抑制劑Olaparib可以治療卵巢腫癌，乳腺癌和結直腸癌。 雖然該藥物并不對所有這類癌癥病人的治療都有效果，但其對BRCA1突變攜帶者表現有明顯治療效果，可能與PARP抑制劑合用引起的協同致死作用與BRCA1缺乏有關。BRCA1突變細胞對PARP抑制劑表現為更加容易被損傷，因為PARP抑制劑誘發的單一鏈DNA斷裂，可導致DNA復制時的雙鏈斷裂，造成BRCA1缺失細胞無法實施同源重組機制來修復損傷的DNA。
根據Olaparib在臨床試驗中獲得的理想效果，FDA于2014年12月批準了該藥用于BRCA1/2突變卵巢癌病人的治療。盡管病人對該藥物有很好的反應效果，然而，在病人和GEM模型研究中都發現了獲得性藥物耐受性。通過臨床前KB1P小鼠模型研究證實，這類耐藥機制與藥物運輸物及同源重組恢復等數量的增加有關。這些研究結果有助于了解臨床上耐藥性的產生, 以及設計針對Olaparib耐藥病人的改進治療策略。
關于腫瘤治療效應與藥物耐受性的關系，現在也是越來越清楚，即其影響不僅受腫瘤細胞自身因素，而且與成纖維細胞和免疫細胞等基質因素有關。通過PDAC的GEM模型進行腫瘤干預研究的結果表明，治療是抑制旁泌性相關信號通路，減少促結締組織增生腫瘤基質，增加腫瘤脈管系統，導致促進抗腫瘤藥物導入腫瘤部位的過程。然而，關于攻擊PDAC中的腫瘤基質的概念，最近有兩個研究對該理論進行了挑戰。這兩研究結果表明，基質因素可能通過阻止腫瘤血管形成，引起不是促進而是抑制PDAC生長。所以，這些研究都揭示了腫瘤微環境在治療耐受性方面，發揮了比過去想象的更加重要的，且復雜的作用。
8. 腫瘤免疫治療
在過去十年，通過對免疫反應的深刻揭示與認識，建立了利用病人免疫系統攻擊腫瘤的治療策略。近年來的黑色素瘤和肺癌臨床病人試驗已證實，包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫檢查點抑制物，在增強病人有效抗腫瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潛力。這些臨床試驗基礎是來自過去幾十年在實驗小鼠模型上開展的基礎研究，從而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反應中的重要性，特別是通過對CTLA-4和PD-1敲除小鼠出現嚴重與溫和程度的自發性自身免疫表型的明確證實，應用CTLA-4抑制物引起接種腫瘤小鼠的抗腫瘤T細胞反應增加，產生腫瘤排斥作用，提示釋放T細胞上的剎車可能是抵抗腫瘤的一個潛力的應對策略。盡管如此，同時也應該清楚的了解，仍有一定比例的病人對此類免疫治療沒有反應，且目前的挑戰是還不知道其真正原因。
目前，雖然絕大部分的免疫學研究都是在腫瘤移植小鼠模型的基礎上進行的，但就現在研究情況預測表明，今后GEM模型應用于該領域的研究將會越來越多。應用GEM模型研究的部分結果表明，在新形成的腫瘤過程中，因腫瘤引起的耐受機制，T細胞喪失其對腫瘤細胞的反應性，特別明顯的是，如果將來自GEM模型小鼠形成的腫瘤細胞，接種至免疫缺陷小鼠體內，腫瘤會快速生長，而野生小鼠則能排斥這些腫瘤細胞。提示這些腫瘤細胞沒有失去其免疫原性，T細胞仍然能識別這些細胞并發揮其攻擊作用。但在原發腫瘤小鼠的體內這些T細胞卻無能為力。
腫瘤常常被認為是慢性炎癥的結果，這種炎癥可引起局部和系統免疫抑制，從而不利于T細胞發揮其有效的功能。而且，腫瘤常表現為樹狀突細胞（DC)功能缺失，導致T細胞啟動缺損。例如，在MMTV-PyMT乳腺腫瘤小鼠模型中發現，原本具有潛在激活抗腫瘤T細胞的DC細胞，會被大量存在的巨噬細胞競爭抑制，這些巨噬細胞起到了阻止特定T細胞激活的作用。最近的研究也證實，促進DC細胞功能或阻止骨髓細胞引起的免疫抑制，可以達到改善免疫檢查點抑制物的抗腫瘤效果。因此，對腫瘤病人實施耐受T細胞免疫激活療法的時候，結合應用針對改善免疫抑制或則增強T細胞啟動的靶點藥物，在臨床上可能會起到更好的治療效果。
相對于腫瘤接種模型，應用GEM模型進行免疫治療研究需要不同的方法。考慮到GEM模型中腫瘤是在每個獨立小鼠體內發生的，如同病人腫瘤的發生過程，具有特殊的腫瘤抗原。因而，具有其異質性的特點，從而確保區別鑒定反應和非反應腫瘤之間的分子不同，也有助于臨床預測的生物標記物的建立。然而，對于大多數GEM模型來源的腫瘤來說，辨認可被T細胞識別的表達腫瘤抗原卻是未知的。為了克服這點，可借助基因修飾的方式，將臨床上相關腫瘤抗原引入小鼠體內，使其具有誘發腫瘤特異性T細胞反應的效果。比如，應用低免疫原性的腫瘤（如肉瘤和肺癌），將腫瘤特異性抗原引入至GEM模型后，這些腫瘤的免疫原性增加，引起潛在而短時間的抗腫瘤T細胞反應。起初的抗腫瘤T細胞反應很快發生，然后是可調控T細胞介導的免疫抑制。因此，這些模型將有助于目前與未來相關研究，以達到揭示免疫逃逸的復雜機制，最終研發具有改善的腫瘤免疫治療的新策略的目的。
9. 與臨床試驗并行的GEM模型
最近推出的“與臨床共試驗” 范例，目的是將臨床前GEM實驗與人體臨床試驗同時開展，從而達到預測治療效果的作用。該策略已經應用于前列腺癌治療中，并成功揭示了由雄性激素誘發的耐受性與某些遺傳關鍵因子有關，以及克服去勢難治性的新綜合療法。同樣，應用NSCLC的GEM模型的一起臨床試驗表明，Kras/Lkb1突變肺癌較Kras or Kras/p53突變腫瘤對臨床上的Docetaxel和MEK抑制劑Selumetinib的聯合療法，表現為更加具有耐受性。揭示了LKB1是臨床試驗中對此類藥物聯合療法耐受的潛在決定因素。這類研究表明，應用GEM模型作為人腫瘤臨床前藥物效果研究，能發現新的生物標記物和聯合療法。
GEM在腫瘤學研究中發展趨勢與未來展望
許多抗腫瘤藥物在臨床試驗中未能達到臨床前實驗的期望目的，已經成為目前腫瘤學與轉化癌癥醫學所面臨的巨大挑戰，如何改善腫瘤學領域的臨床前研究結果的預測性，也是人們十分關注的熱點。因此，如何選擇更能真實反映人腫瘤疾病發生發展過程的臨床前腫瘤動物模型，將顯得更加重要了。為了實現這一目的，首先需要考慮的是如何建立能真實反映腫瘤本身及外在特征的臨床前小鼠模型。比如，臨床前模型應該含有病人特異性突變，該種突變具有誘發惡性腫瘤的趨勢，且在一定病人群中顯示遺傳變化特征。另外，原發的腫瘤過程是在自然微環境中進行的，如同在人腫瘤進行過程中所見的腫瘤細胞與腫瘤微環境之間相互作用（包括免疫細胞，成纖維細胞，以及淋巴細胞和血管的潛入）。再有，由于絕大多數進入臨床試驗的病人已經是處于廣泛腫瘤轉移疾病過程中，因此，實驗設計時就應該考慮選擇能模擬病人疾病不同進程狀態的小鼠模型，開展相應的臨床前的藥物效果評估研究。在現實的臨床試驗中，往往進入臨床試驗的病人之前多是經過不同程度的治療，因而極有可能會干擾治療效果的驗證。而臨床前的動物研究則是建立在從來沒有接受任何治療的基礎上進行的，從而導致高估治療效果的結果。從另外一方面講，臨床試驗中對那些接受過治療的嚴重病人沒有效果，卻仍有可能對沒有接受過治療的嚴重病人有益處。
最近基因修飾模式動物技術的進展，促進了快速研制更加精準的能引起原發腫瘤的小鼠模型，該類模型結合了特異性腫瘤病人形成發生發展過程中腫瘤細胞本身和細胞外的特征。預測這些新一代的GEM模型和基于GEM模型的移植模型，將是真實模擬病人腫瘤發生發展過程，研究自發性轉移疾病的最佳模式動物。這些模型可作為研究腫瘤形成的復雜過程（包括腫瘤的起始，器官特異性轉移的形成，腫瘤微環境的參與等方面）的重要而有用工具。但是，對于腫瘤病人而言，更加重要的是，這些模型能更為深入地揭示免疫治療中的反應性與耐受性，以及疾病的復發等相關機制。期待未來，應用新一代GEM模型對抗腫瘤新藥物臨床前的評估研究，將會增加預測其在臨床試驗中的成功率，從而加速抗腫瘤新藥策略設計與臨床實施，達到改善防治腫瘤病人的病情的最終目的。
作者簡介
俞曉峰博士，國際知名模式動物和細胞生物學專家，先后就任于耶魯大學醫學院、iTL基因打靶公司和紐約大學醫學院以及美國ASC生物技術公司等機構，在遺傳修飾模式動物領域有超過20年的研發和管理經驗。目前任職于賽業生物科技，任高級副總裁和高級科學家，主要負責基因修飾模式動物平臺的技術工作，其研究成果多次發表在Nat Immunol、Mol Cell Biol等高水平雜志上。
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