基因工程的載體和工具酶3

2.M13噬菌體載體的構建

⑴ 在IS區內插入LacZ基因 ⑵在標記基因區內組裝MCS區段

所以能通過a互補在X-Gal/ IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等

這類載體的突出優點在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表現不穩定，在噬菌體增殖過程中容易發生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內，克隆300-400bp的片段十分穩定。

（三）柯斯質粒載體

1.柯斯質粒載體的特點

柯斯質粒是一類人工構建的含有lDNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體，cosmid是cos site carrying plasmid的縮寫。

柯斯質粒的大小為4-6kb，

由3部分組成：

A.多克隆位點區

B. 含有cos位點的lDNA區

C. 復制起始位點和抗性標記區

2.柯斯質粒載體的特性

1、具有l噬菌體的特性 柯斯質粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉導寄主細胞。進入寄主細胞的DNA也能環化和復制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發生溶菌現象。

2、具有質粒載體的特性 能象質粒一樣在寄主細胞內復制，且帶有抗性選擇標記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。

3、高容量的克隆能力 cos質粒本身很小，只有復制起點、選擇標記和cos位點等構成，所以其克隆上限可達45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達到30kb。

四種常用載體的比較

第二節基因操作的工具酶

一、限制性核酸內切酶及其應用

（一）限制性核酸內切酶的發現

當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能識別已甲基化的序列。B

最早分離出的限制內切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒有實用價值。

首個II型限制內切酶是在1970年，由H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。

從此，相關研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內切酶中，其中有30%是在NEB發現的 。

限制性核酸內切酶（restriction endonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。切開的是3，5－磷酸二酯鍵。

（二）限制性核酸內切酶的分類

分為I型、II型和III型。

（三）限制性核酸內切酶的命名

1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體

字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；

2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；

3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數字標出，比如Eco R I、 Hin。d III

（四） II型限制性核酸內切酶的基本特性

1、識別位點的特異性

每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4～8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

2、識別序列的對稱性

靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。

3、切割位點的規范性

交錯切或對稱切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。