基因組學研究成果讓斑馬魚研究“快馬加鞭”

基因組學研究成果讓斑馬魚研究快馬加鞭
（Genomics: Zebrafish earns its stripes）

作者：謝訓衛

人類發育，生理功能及疾病發生的過程涉及到成千上萬的基因和其變異體，但是大部分的基因和其變異體的功能依然是未知的。過去的20年里，斑馬魚逐漸成為研究人類基因功能的重要模式動物。在《自然》雜志網站發表的兩篇文章里，報道了斑馬魚參考基因組序列和完成超過10,000個蛋白編碼基因的斷裂性突變體的鑒定，與最近的研究報道一起將有力地促進人類疾病研究。

常見的研究基因功能的手段是確定某個特定的突變對機體表型的影響，如骨骼，生理機能和行為模式等。斑馬魚胚胎和幼魚具有個體小，易于獲取，胚體透明等特點，可以在單細胞水平上進行大量活體檢測分析，十分適于此種研究。斑馬魚基因功能大部分是通過“正向遺傳學”手段揭示的，首先在斑馬魚基因組中引入隨機突變，在子代中鑒定表型的改變（fig. 1a）。使用這種方法鑒定致畸突變工作量很大，但在很大程度上幫助人們揭示了從胚胎發育到心臟生理機能調控等眾多遺傳途徑。

由Howe et al研究人員報道的高質量的斑馬魚基因組序列，使得將突變序列和野生序列直接進行比對變為可行，將極大地促進突變的鑒定。斑馬魚基因組序列顯示75%的人類疾病相關基因都可以在斑馬魚中找到同源基因，從而我們可以利用斑馬魚進行疾病相關基因的功能研究。

Figure 1表型與基因的聯系。斑馬魚中常見的三種研究特定基因在機體表型中功能的方法。a, 正向遺傳學，向成年魚中引入隨機突變，在子代中鑒定表型變異，分析基因組以尋找突變基因。b, 另一種方法是先進行隨機突變，但接下來對子代全基因組序列比對以尋找突變，進而確定表型的改變。c, 針對特定靶基因的突變技術，向某個特定的基因引入突變再分析子代的表型。

但是如何在斑馬魚中研究一個特定的人類基因的功能呢？首先需要向斑馬魚同源基因引入突變，接下來進行表型分析（fig. 1b）。Kettleborough et al 證實了可以大規模地進行類似的實驗。該作者將雄性斑馬魚進行隨機突變，隨后對子代基因組DNA的蛋白質編碼區域進行測序。在1,673尾魚中，研究人員鑒定出10,043個基因（超過1/3的所有斑馬魚蛋白編碼基因）存在著破壞。這些突變品系將成為系統研究這些基因功能的寶貴資源。

另一種研究基因功能的方法是針對特定基因引入突變，而不是向整個基因組引入隨機突變（fig. 1c）。隨著在特定位點剪切DNA的技術的出現和完善，基因突變技術發生了根本性的變化。最新報道的技術是CRISPR-Cas9系統，已成功應用于斑馬魚。該技術的核心是一個與靶基因的部分序列互補的RNA分子，引導核酸內切酶到靶基因的特定DNA位點，進行剪切，進而通過易錯修復機制引入突變。CRISPR-Cas9系統相對大規模的突變篩選要便宜，快速些，可以被較小的實驗室采用。因此大部分的斑馬魚基因相應突變體的產生只是一個時間的問題。

雖然有這些突破性的發現，但我們對于有多少基因在發生破壞時會產生相應的表型還不太清楚。根據之前的正向遺傳學篩選結果，推測有大約有不到10%斑馬魚基因的破壞會在胚胎和幼魚期的前5天產生異常表型。與之一致的是，Kettleborough et al發現在超過800個基因中，僅有大約5%的基因是這個時期正常發育所必需的。

是否這意味著超過90%的斑馬魚基因是功能無關的？以下有幾點考慮使得這個說法完全站不住腳。首先，Kettleborough和同事們在進行表型分析時僅包括了十分明顯的結構上的特征，相對細微的表型經常被忽略掉。其次，許多基因僅在晚期發育或成年期中發揮功能。第三，在早期發育時期，基因功能的破壞常被存在于卵黃或胚體中的母源因子所補償。最后一點，具有相似序列的基因通常擁有重疊或部分冗余的功能，導致單個基因的破壞沒有表型或是只有輕微的表型。

Howe et al 發現1/4的斑馬魚基因擁有高序列相似性的同源基因，說明上述最后一點在斑馬魚中尤其適用。然而，所有這些可能性都可以通過可應用于斑馬魚的精細技術來解決：表型的分析可使用高分辨率的拍攝技術和基因表達譜；突變魚可用于發育晚期的研究；產生無母源和合子期基因表達的突變魚，或在同一機體中同時敲除2-3個相關基因相對變得容易。

這些工具和資源將如何加速人類疾病相關基因的研究？方法很明了，尋找人類疾病相關基因在斑馬魚中的同源基因并進行編輯，分析異常表型，使用高通量的藥物篩選平臺尋找或鑒定可以調節該表型改變的小分子化合物。另外，斑馬魚基因組序列的完成，使得我們可以使用新的研究手段去解決長期以來困擾人類的問題。比如，斑馬魚具有很高比例的遺傳變異——Howe et al發現在不同的品系甚至于在不同的個體中，每隔200bp就有一個變異。在其他生物體中的研究顯示這樣的差異會導致表型效應。可以想象斑馬魚將成為研究輕微基因型變異在表型差異中的作用的一個有用的脊椎模式動物。

斑馬魚基因組序列的完成是否會在生物學中引入新觀念？非常有可能。很明顯人類基因組序列的公布并沒有帶來很大的改變。比如，沒有人預測大量的非編碼蛋白的RNA分子在功能調控中的重要作用，或是預見使用基因組序列去重建人類進化史？斑馬魚基因組序列和突變體的收集也許是下一個重大發現的前兆。

Alexander F. Schier現就職于哈佛大學分子與細胞學系，劍橋鎮，馬薩諸塞州 02138，USA

Email: schier@mcb.harvard.edu

1 Howe, K. et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature, doi:10.1038/nature12111 (2013).

2  Kettleborough, R. N. et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature, doi:10.1038/nature11992 (2013).

3  Varshney, G. K. et al. A large-scale zebrafish gene knockout resource for the genome-wide study of gene function. Genome research 23, 727-735, doi:10.1101/gr.151464.112 (2013).

4  Hwang, W. Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229, doi:10.1038/nbt.2501 (2013).

5 Chang, N. et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos. Cell research 23, 465-472, doi:10.1038/cr.2013.45 (2013).

6  Zu, Y. et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature methods 10, 329-331, doi:10.1038/nmeth.2374 (2013).

7  Bedell, V. M. et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature 491, 114-118, doi:10.1038/nature11537 (2012).

8  Driever, W. et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development 123, 37-46 (1996).

9  Haffter, P. et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123, 1-36 (1996).

10 Solnica-Krezel, L., Schier, A. F. & Driever, W. Efficient recovery of ENU-induced mutations from the zebrafish germline. Genetics 136, 1401-1420 (1994).

11   Zon, L. I. & Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. Drug discovery 4, 35-44, doi:10.1038/nrd1606 (2005).

12   Lander, E. S. Initial impact of the sequencing of the human genome. Nature 470, 187-197, doi:10.1038/nature09792 (2011).