基因編輯crispr原理

ZFN

ZFN，即鋅指核糖核酸酶，由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。DNA 識別域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯組成（一般 3~4 個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯體堿基。鋅指蛋白源自轉錄調控因子家族（transcription factor family），在真核生物中從酵母到人類廣泛存在，形成alpha-beta-beta二級結構。其中alpha螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的DNA結合特異性，骨架結構保守。對決定DNA結合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的DNA結合特異性。多個鋅指蛋白可以串聯起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的堿基序列，具有很強的特異性和可塑性，很適合用于設計ZFNs。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自FokI的C端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內切酶，只在二聚體狀態時才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當的距離時（6~8 bp），兩個單體ZFN相互作用產生酶切功能。從而達到 DNA 定點剪切的目的。

TALEN

TALENs中文名是轉錄激活因子樣效應物核酸酶，TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應子一種由植物細菌分泌的天然蛋白來識別特異性DNA堿基對。TAL效應子可被設計識別和結合所有的目的DNA序列。對TAL效應子附加一個核酸酶就生成了TALENs。TAL效應核酸酶可與DNA結合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導入新的遺傳物質。相對鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能夠靶向更長的基因序列，而且也更容易構建。但是直到現在，人們一直都沒有一種低成本的而且公開能夠獲得的方法來快速地產生大量的TALENs。

CRISPR

CRISPR是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統。微生物學家10年前就掌握了細菌擁有多種切除外來病毒基因的免疫功能，其中比較典型的模式是依靠一個復合物，該復合物能在一段RNA指導下，定向尋找目標DNA序列，然后將該序列進行切除。許多細菌免疫復合物都相對復雜，其中科學家掌握了對一種蛋白Cas9的操作技術，并先后對多種目標細胞DNA進行切除。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。但最近研究發現，雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量“誤傷目標”，尤其是對不希望改變的基因做修改。

三種系統的比較

那么，可能會有人疑問了，既然如此，這三種系統的區別和聯系又是什么呢？特意從有效性，特異性，載體性及其它四個方面，進行了一個小小的總結。

有效性

在不同的基因位點基因靶向性的有效性都是不同的，并且這也依賴于每種細胞的轉染的效率。因此，只能點對點的比較靶向位點，細胞系和轉染方法，這樣的比較才有意義。基于我們課題組和其他課題組的ZFN和TALENs的靶向效率的實驗，我們在細胞系水平上進行了比較，雖然他們可能與不同的突變特征有關。Chen的課題組的最近的研究進行了大規模的體外分析，發現TALENs在使用與上下游相關的序列的時候比ZFNs顯著的具有更多的突變產生。另一個組比較了TALENs和CRISPRs在人類ESCs細胞中的情況，觀察到，通過用CRISPR更換掉TALENs，在其他方面條件相同的情況下，通過產生更多的基因突變的克隆，本質上提高了效率。最近，功能上重新編碼的TALENs（reTALENs）已經得到了發展，并且在人類的iPSCs細胞中的基因編輯的有效性相比較于CRISPR得到了提高。但是這個研究發現，CRISPR比reTALENs能夠實現7-8倍的同源重組效率，并且其一定程度的比HE更有效率，擋雨ODN捐贈者進行比較。

特異性

ZFN和TALENs都是作為二聚體發揮作用的，其特異性是由DNA綁定的區域決定的，這個區域在每個剪切位點最多可以識別36bp。然而，在在II型CRISPR系統中的Cas9是由一種RNA引導的核酸，它的特異性是由PAM和PAM上游的20個引導核苷酸決定的。這表明，3’12個堿基的“種子序列”是最關鍵的，而剩下的8個堿基（非種子序列）甚至PAM序列都是可以錯配的。ZFN的特異性由一種不帶偏見的全基因組分析進行，并且發現存在頻率低，但是可以檢測到的脫靶事件的發生，其可以定義為一個高度有限的一部分。已經有研究表明，TALENs有比ZFN更低的細胞毒性和脫靶效率。
基于這個研究，TALENs誘導的CCR5特異性突變在CCR5的對偶基因上發生率是17%，而在高度同源的CCR2位點上只有1%。相反，CCR5特異性的ZFN的活性在這兩個位點是相在當的，CCR5位點的突變頻率是14%，而CCR2的是12%。幾個研究也報告了，CRISPR/Cas系統在細胞毒性評價或者DSB誘導的檢測（即，H2AX免疫染色）中都沒有明顯的脫靶現象。然而，最近的研究發現，CRISPR誘導的靶向不同的人類細胞的基因出現了顯著的脫靶現象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系統偶到的在CCR2上的脫靶切除的突變率為5-20%，這是非常接近之前討論的CCR5靶向的ZFN誘導的突變率。三個其他的小組利用更系統的方法在人類細胞中評估了CRISPR的脫靶活性，其結果表明CRISPR可能能夠發生目標不匹配，從而在預測的脫靶位點上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位點的定位和內涵能夠顯著的影響gRNA識別他們的靶向目標，而在基因組序列中的“脫靶序列”也是一樣的。已經有報告說，脫靶效應能夠通過小心的控制Cas9的mRNA的濃度來克服。此外，在基因編輯的時候使用配對的Cas9的切口酶已經表明能夠顯著的減少至少1500倍的脫靶活性。

病毒為基礎的傳遞

ZFN基因可以通過慢病毒和腺病毒進行傳遞。當前，ZFNs導入體細胞是通過共轉染兩個慢病毒載體，每個載體編碼一個功能性異源二聚體對的一個單體。相反，腺病毒，但不是基于HIV的慢病毒，載體使用與TALEN的基因的傳遞，因為TALENs的大尺寸和TALE重復序列的種應用。Cas9也是一個較大的基因，并且其酶促死的版本也可以通過慢病毒進行傳遞，雖然也盛行的Cas9的穩定的表達對于細胞的毒性依然是不清楚的。

其他方面

ZFNs和TALENs都能夠在切割時產生粘性末端，因此可以使用標簽綁定，如果具有互補突出部分的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）是可以進行預測的。ZFNs和TALENs都可以在捐贈的質粒的基因組中引入同一個核酸靶向位點來實現。ZFNs和TALENs通過采取同源二聚體的方式從而獲得優勢，綁定門通過設計實現了重組（Ob-LiGaRe）。這種方法在使用的質粒中倒置了兩半的核酸酶的結合位點，這是在沒有改變接頭區的方向實現的，因此通過相同的ZFN/TALEN堿基對能夠阻止連接產物的消化。因為CRISPR產生了一個非粘性末端，直接連接會遇到挑戰。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的堿基對能夠誘導具有徒步部分的DSBs，并且促進dsODN的高效率的NHEJ介導的插入。雖然至今還沒有出版，但是進入的轉基因大小的DNA能夠通過引入在目標質粒的CRISPR/Cas9靶向位點的具有CRISPR/Cas的基因組使用。CRISPR/Cas系統相比較于ZFNs和TALENs具有幾個優勢，例如易于構建，花費低，并且產物具有可擴展性，并且能夠用于多個靶向基因組位點。