基因的翻譯表達2

方法

1：重組載體構建同前面實驗

2：誘導表達：提取帶重組片斷的質粒DNA轉化BL21（DE3）受體菌37℃活化過夜，轉入新鮮培養基搖菌至對數生長期（約2－3小時），加入IPTG至終濃度0.4mM，繼續培養6小時

3：表達產物提取及鑒定見實驗十九

二：融合表達

儀器：同上

材料及試劑：載體PinPointX(圖17-2),菌株JM109，誘導劑IPTG及PinPoint純化試劑盒所帶試劑。

圖17-2PinPointXa載體結構圖

方法

1：重組載體構建同前面實驗

2：誘導表達：提取帶重組片斷的質粒DNA轉化JM109受體菌37℃活化過夜，轉入新鮮培養基(含2mMbiotin)搖菌至對數生長期（約2－3小時），加入IPTG至終濃度0.1mM，繼續培養4-5小時

3：表達產物提取及分析按圖17-3進行.

其原理為Softlink樹脂上結合有生物素親和基團,該基團能與融合蛋白中來自于載體的前導肽親和結合,因此利用親和層析原理可特異性提取純化融合蛋白.由于來自以載體的前導肽的C末端有專一性的Xa蛋白酶的作用位點,因此純化后的融合蛋白用Xa蛋白酶切割,即可釋放出外源基因蛋白

具體為

A:細胞裂解(冰浴操作)

a:離心沉淀細胞,沉淀懸浮于10倍體積(ml/g細胞沉淀)的細胞裂解液(50Mm Tris-HCl,pH7.5,50mMNaCl,5%甘油)

b:加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml,冰浴攪拌20min

c:加入DOC(脫氧膽酸鈉鹽)到終濃度0.1%,冰浴攪拌5min

d:加入200UDNase以降低黏度

e:10000g,15min離心取上清

B:上柱

a:裝柱,用含5mM生物素的平衡液(50mMTris-HCl,pH8.0,含50-200mMNaCl,4Mmdtt,2Mmedta,10%甘油或0.1%TritonX-100)(2倍柱體積)浸泡柱材(Softlink樹脂),取1ml裝入專用層析管中

b:平衡柱,用8柱床體積的10%乙酸洗柱,再用8柱床體積的100mMpH7.0磷酸鹽(磷酸鈉)緩沖液洗柱(要求流出液pH達到6.8)

c: 用1體積平衡液平衡柱

d:將細胞裂解后的上清液濃縮后溶于平衡液中,上樣

C:洗脫

a:洗柱,上樣后用5柱床體積的平衡液洗柱,以洗脫未結合到柱上的雜蛋白

b:洗脫蛋白,用含5mM生物素的平衡液洗脫,直至蛋白峰出現。