基因的轉移與重組體的篩選和鑒定2

二、重組DNA分子轉入真核細胞

1. 根癌農桿菌Ti質粒介導法

農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法是目前研究最多、機制最清楚、技術方法最成熟的基因轉化途徑。迄今為止約8096的轉基因植株都是利用農桿菌介導轉化系統獲得的。

農桿菌是一類土壤習居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，而對絕大多數單子葉植物無侵染能力。植物受傷后，傷口處細胞分泌大量的酚類化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH－As），它們是農桿菌識別敏感植物的信號分子。具有趨化性的農桿菌移向這些細胞，并將其Ti質粒上的T－DNA的轉移至細胞內部。根據這一性質，將待轉移的目的基因組入Ti質粒載體，通過農桿菌介導進人植物細胞，與染色體DNA整合，得以穩定維持或表達。

步驟：（1）外植體選擇與預培養；（2）接種活化的農桿菌工程菌；（3）共培養；（4）選擇培養；（5）轉化植株再生

2. 高壓電穿孔法

利用脈沖電場將DNA導入受體細胞的方法叫做高壓電穿孔法。利用這種方法，可以將DNA導入動、植物及細菌細胞。具有簡單方便、對細胞毒性低以及轉化效率高等優點。

（1）標準的操作程序——將高濃度的含有克隆基因的質粒DNA加到原生質體的懸浮液中，然后置于200～600V／cm的電場下進行電脈沖刺激。經過如此電穿孔處理的原生質體在組織培養基中培養1～2星期之后，選擇已經捕獲了轉化DNA的細胞，作進一步的繼續培養，以便獲得再生植株。

應用這種方法已成功地轉化了玉米和水稻的原生質體，其轉化效率在0．1％～1．0％之間。

（2）影響電穿孔導入DNA效率的因素：

① 外加電場的強度：250～750 V／cm較宜；

② 電脈沖的時間：20～100ms；

③工作溫度：對不同類型細胞所要求的條件不同，可以在0℃至室溫（25℃）之間進行選擇；

④ DNA的構象和濃度：線性 DNA比環狀 DNA要好，濃度控制在1～ 40 μg／mL。

⑤工作緩沖液的離子成分：也對其DNA導入效率發生作用，一般用鹽溶液懸浮細胞要比用非離子溶液更易DNA的導入。

3. 聚乙二醇介導的原生質體轉化法

這種方法常用于轉化酵母細胞以及其他真菌細胞。

活躍生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶處理變成球形體后，在適當濃度的聚乙二醇6000（PEG－6000）的介導下，將外源DNA轉化入受體細胞中。

4. 磷酸鈣或DEAE一葡聚糖介導的轉染

這是將外源基因導入哺乳類細胞中進行瞬時表達的常規方法。

將被轉染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后通過內吞作用進入受體細胞。對于DEAE-葡聚糖作用的機理尚不清楚，可能是其與DNA結合從而抑制核酸酶的作用或與細胞結合從而促進DNA的內吞作用。

5. 原生質體融合

通過帶有多拷貝重組質粒的細菌原生質體同培養的哺乳細胞直接融合。經過細胞膜融合，細菌內容物轉入動物細胞質中，質粒DNA被轉移到細胞核中。
6. 脂質體法

將DNA或RNA包裹于脂質體內，然后進行脂質體與細胞膜融合將基因導入。

脂質體是由磷脂組成的膜狀結構，用它包裝外源DNA分子，然后與植物原生質體共保溫。于是脂質體與原生質體膜結構之間發生相互作用，爾后通過細胞的內吞作用而將外源DNA高效地納入植物的原生質體。

這種方法具有多方面的優點，包括可保護DNA在導入細胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了對細胞的毒性效應，適用的植物種類廣泛，重復性高，包裝在脂質體內的DNA可穩定地貯藏等。用此法轉化水稻原生質體的效率可達14％，并得到了轉基因的再生植株。

7. 顯微注射法

借助顯微鏡將外源DNA直接注射到受體細胞的方法。適用于此種方法的植物樣品包括原生質體、游離的細胞，以及諸如愈傷組織、分生組織和胚胎組織等多細胞結構。

在顯微注射的實際操作中，受體細胞或組織是被固定在褐藻酸鈉或瓊脂糖等特定載體上，然后通過顯微操作器，將轉化的外源DNA直接注射到受體細胞核中去。由于一些重要的禾本科糧食作物均為單子葉的，在原生質體再生和Ti質粒的轉化方面都存在著相當的困難，所以對此類植物來說，DNA的直接注射法具有特別重要的實用價值。

本法的一個突出優點是轉化頻率高，可達60％以上，但操作困難，需要經過特殊訓練的專門技術人員才能迸行。

8. 顆粒轟擊（particle bombardment）技術

顆粒轟擊技術是將基因轉移到細胞或組織中去的通用方法，也就是平常所說的用基因槍實現基因轉移的方法。

將DNA包被在金或鎢的微粒中，然后用基因槍將DNA包被的顆粒直接轉移到原位組織、細胞乃至細胞器中去。這一技術目前廣泛用于植物基因工程、基因治療以及基因（DNA）免疫等研究。

生物彈擊法的操作對象可以是完整的細胞或組織，突破了基因轉移的物種界限，也不必制備原生質體，實驗步驟比較簡單易行，具有相當廣泛的應用范圍，已經成為研究植物細胞轉化和培養轉基因植物的最有效的手段之一。

第二節 基因重組

將目的基因插入載體的過程，即基因重組（gene recombination)，其基本過程包括：首先在目的目的基因和載體兩端造成切口，然后依賴于雙鏈DNA粘性末端單鏈序列的互補結合和DNA連接酶將切口補上。這一步的實質就是將兩種DNA在體外進行酶促連接，最終獲得一個重組子。一般連接反應中外源DNA與載體的比例采用3：1，4：1或5：1。

不同來源、性質的外源片段采用的連接方式不同。常采用的連接方法有：粘末端連接、平端連接法、人工接頭法和同聚物接尾法。

一、粘末端連接

1. 全同源粘性末端連接

如果目的序列與載體兩端具有相同的限制內切酶位點，則同一限制性核酸內切酶酶切后在目的基因與載體兩端產生完全相同的粘性末端，在降低溫度退火時，能重新互補結合，在DNA連接酶催化下，目的序列與載體DNA連接，實現基因重組，稱為全同源粘性末端連接。另外，不同的限制性內切酶，如果產生的粘性末端相同，也同樣用此方法連接。

該連接方法的優缺點為：

優點：該方法是最方便的克隆方法，其連接效率高，一般采用低濃度酶在低于16度，高濃度ATP的情況下進行連接。

缺點：容易出現載體自身環化、雙向插入（即目的基因以兩種方向插入載體和多拷貝插入的現象，從而在轉化后出現高背景，使得篩選更為困難。雙向插入盡管對基因克隆無影響，卻會影響基因的表達。采用堿性磷酸酶事先對載體DNA進行去磷酸化處理，可有效避免載體自身環化現象；建立連接體系時，若將目的基因和載體DNA的摩爾數控制在2~3：1，則可有效減少多拷貝插入的問題。