多孔培養板中單層培養細胞生長曲線的繪制實驗

材料

無菌

單層細胞培養：A549、Vero 或 HeLa-S3, 75 cm² 培養瓶，晚對數期 1 瓶

0.25% 粗制胰蛋白酶混合有 10 mmol/L EDTA 5 ml

生長液，100 ml, 伴有 26 mmol/L NaHCO₃ 300 ml

D-PBSA(預洗并用于細胞計數）50 ml

12 孔培養板 10 塊

非無菌：

用于裝培養板的塑料盒
CO₂ 溫箱或 5% CO₂ 以充盈塑料盒

操作步驟

1. 對于一般的傳代，先用胰蛋白酶消化細胞（見方案 13.2)。

2. 稀釋細胞懸液分別至 1X10⁵ 個/ml，3X10⁴ 個/ml 和 1X10⁴ 個/m l，每種濃度均含 25 ml 培養基。

3. 用 3 塊 12 孔板，每孔一種細胞濃度，每孔 2 ml 細胞懸液。最上面四孔加 1X10⁴ 個/ml，第二排加 3X10⁴ 個/ml，第三排加 1X10⁵ 個/ml (圖 21. 7)。從孔的中央處慢慢地將細胞懸液加入，這樣不會使液體在孔內產生旋渦。同樣地不要搖動培養板以期混合細胞，因為培養基的圓周運動會使細胞集中在孔的中央。

4. 將培養板賈于濕潤的 CO₂ 濕箱內，或者用 5%C0₂ 充盈塑料盒，然后封閉。

5. 24 h 后，將培養板從溫箱中取出第一塊板，計數每種濃度的 3 個孔中的細胞數：

(a) 將含有要計數細胞的 3 個孔中的培養液完全吸掉；
(b ) 加入 0.5 ml 胰蛋內酶/EDTA 至上述 3 個孔中；
(c) 溫育培養板 15 min；
(d ) 加人 0.5 ml 含血清的培養基，在胰蛋白酶/EDTA/培養基中將細胞分離開來，取 0.4 ml 細胞懸液至 19.6 ml 的 D-PBSA 中；
(e) 用電子細胞計數器計數細胞。

6. 染剩余不同密度孔中的細胞（見 16. 4.2 節）。

提示 也可以用血球計數板進行細胞計數，但這對于細胞濃度較低者比較困難。如果要用血球計教板，可將胰蛋白酶的容積減少至 0.1 ml，小心地用微吸管將細胞分散，使之不產生氣泡，然后將細胞移至血球計數板。

7. 如第 5 、6 步，在 48 和 72 h 時重復取樣。

8. 于 72 h 時或者更早一些時間換培養液，這可依據 pH 的下降來決定（見方案 13.1，彩圖 22b )。

9. 對于迅速生長的細胞（即 PDT 為 12～24 h 的細胞）可以每天連續取樣，但是對于生長緩慢的細胞（也就是 PDT > 24 h )，則每兩天取樣，直至細胞達到平臺期。

10. 依據 pH 的改變，每 1、2 或 3 天換培養基。