多肽類藥物的藥代動力學研究

蛋白多肽類藥物的體內檢測難度很大，要求檢測方法應具有高度的專屬性，以及極高的靈敏度。傳統的光譜法、生物檢定和免疫分析等方法均有一定的局限性，而LC-MS/MS集高效液相色譜的高分離性能與質譜的高靈敏度、高專屬性于一體，已迅速成為藥物代謝與藥物動力學研究中采用的主要分析方法。

戈舍瑞林（Goserelin）是一種治療乳癌和前列腺癌的多肽類藥物，艾塞那肽（Exenatide）是首個化學全合成的腸促胰島素類似物，可降低2型糖尿病患者的空腹和餐后血糖。

和傳統藥物比較，蛋白多肽類藥物的體內檢測面臨相當大的難度，其主要原因是：一，這類藥物多為生理活性物質，化學結構特殊，穩定性差，體內處置十分復雜。二，生物體內存在大量干擾物質，如結構相同或相似的內源性蛋白多肽類物質，細胞因子、蛋白類治療藥物降解產物、體液基質、體內結合蛋白以及針對治療藥物的抗體等。故要求檢測方法應高度特異，如何特異地將目標蛋白多肽分子與干擾物質區分是一大難題。三，該類藥物生理活性強，用藥劑量很小，通常為微克級水平，致體液中藥物濃度極低，故要求檢測方法必須具有極高的靈敏度。

以往蛋白多肽研究主要依賴光譜法、生物檢定和免疫分析等方法。其中光譜法的專屬性和靈敏度較低，主要適用于分析生物樣本中含量較高的藥物；生物檢定缺乏特異性、靈敏度差且耗時；免疫法的特點是快速、簡便和靈敏度高，但該方法建立時須針對每一種藥物制備特異性抗體和標記藥物，通常需要購買相應的試劑盒，且不適用于多組份復雜藥物的分析，所以主要局限于生化藥物的樣本分析。

LC-MS/MS檢測的專屬性和靈敏度等優勢，已迅速成為藥物代謝與藥物動力學研究中采用的主要分析方法。

TSQ Vantage質譜儀的優越性能來源于它在離子傳輸方面的技術創新。新型的S形離子光學透鏡系統使用新型的靜電場技術捕獲離子，并有效地將其傳輸進入雙曲面四極桿質量分析器。相比以Skimmer為基礎的離子傳輸設計，S形透鏡設計具有顯著的先進性，它可消除質量歧視，并降低昂貴的分子渦輪泵的氣體負荷。這項創新設計可保持更干凈離子光學傳輸路徑，同時降低了背景噪音，提高了靈敏度。除此之外，TSQ Vantage質譜儀采用的四級桿是共軛雙曲面四級桿，符合理論上四級桿中的電場分布，因而使其擁有高選擇性離子檢測模式，可以用于排除共流出物中質荷比相近化合物的污染，顯著提高復雜樣品中的靈敏度。總之，這套新系統使小分子、生物分子及多肽領域的科學家能夠檢測超痕量的化合物，并具有極佳的精密度和重現性。

實驗部分

儀器與試劑

TSQ Vantage串聯質譜儀（Thermo Fisher Scientific公司），配置Surveyor液相色譜系統（Thermo Fisher Scientific公司），Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm）。

標準品：戈舍瑞林1.0mg，用甲醇:0.2%甲酸（80:20）配制并稀釋成濃度為1.0 mg/ml的混合標準溶液；艾塞那肽1.0mg，用甲醇:0.2%甲酸（80:20）配制并稀釋成濃度為1.0 mg/ml的混合標準溶液。

甲醇（德國Merck公司），甲酸（HPLC級，Thermo Fisher Scientific公司），水為二次蒸餾水。

色譜與質譜條件

戈舍瑞林色譜條件：Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm），柱溫35℃；流動相A為0.01%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.20ml/min；進樣體積：10μl。

戈舍瑞林質譜條件： ESI正離子模式；噴霧電壓：4.0KV；鞘氣：25arb；輔助氣：10arb；毛細管溫度：380℃；碰撞氣：氬氣（1.5mtorr）。采用選擇反應監測（SRM）掃描模式，戈舍瑞林的SRM參數見表3。

艾塞那肽色譜條件：Thermo Hypersil Gold C18柱（100×2.1mm，3μm），柱溫35℃；流動相A為0.2%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：0.20ml/min；進樣體積：10μl。

艾塞那肽質譜條件： ESI正離子模式；噴霧電壓：4.5 KV；鞘氣：35arb；輔助氣：10arb；毛細管溫度：350℃；碰撞氣：氬氣（1.5 mtorr）。采用選擇反應監測（SRM）掃描模式，艾塞那肽的SRM參數見表3。

結果與討論

LC-MS/MS方法優化及靈敏度考察

經優化流動相和質譜參數，采用ESI正離子模式檢測，經各質譜參數優化后，兩種多肽類藥物戈舍瑞林和艾塞那肽均有很高的靈敏度，定量限分別為2pg/ml和20pg/ml。碰撞能量優化結果見圖1（a）和圖1（b）。在該實驗條件下所得典型LC-MS/MS色譜圖見圖2（a）~圖2（d）。

方法的線性和重復性考察

戈舍瑞林：將濃度為1mg/ml的混合標準溶液逐級稀釋成1000、200、100、20、10、5、2 pg/ml系列標準溶液，分別進樣分析。以分析物子離子色譜峰面積對質量濃度作標準曲線，所得線性方程及線性系數見圖3（a）。2 pg/ml樣品連續進樣3次，RSD為7.36%，重復性滿足要求。

艾塞那肽：將濃度為1 mg/ml的混合標準溶液逐級稀釋成2000、1000、200、100、50、20 pg/ml系列標準溶液，分別進樣分析。以分析物子離子色譜峰面積對質量濃度作標準曲線，所得線性方程及線性系數見圖3（b）。20 pg/ml樣品連續進樣3次，RSD為9.17%，重復性滿足要求。

結論

實驗表明，高效液相色譜－電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)檢測方法靈敏度高，定量限分別達到了2 pg/ml和20 pg/ml，標準曲線線性良好，重復性滿足要求。

除了考察標準溶液，實驗中我們還以犬血漿基質預處理后添加樣品（2ng/ml）為分析對象，分別考察了分辨率分別為FMWH=0.7和FMWH=0.2時的性噪比和選擇性。結果表明，分析戈舍瑞林時，FMWH=0.2時樣品的性噪比S/N提高2.3倍，選擇性增強；分析艾塞那肽時，FMWH=0.2時樣品的性噪比S/N提高了5倍，同時在復雜基質中極大地改善了色譜分離度。結果表明，TSQ Vantage具有的高選擇性離子檢測模式可以極大地改善在復雜基質中樣品的選擇性和性噪比，尤其在血漿和組織這樣復雜的生物樣本中優勢更為明顯。